细胞增殖和细胞工程

细胞的分裂入门

细胞分裂的主要方式

细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，是重要的生命活动。它通过细胞分裂增加细胞数量，通常包括物质准备（如 DNA 复制）和细胞分裂两个连续阶段。

根据细胞类型的不同，细胞增殖的方式也有所区别：

原核细胞：主要通过二分分裂（Binary Fission）进行增殖，过程相对简单，DNA 复制后细胞直接一分为二。
真核细胞：主要有三种方式：
- 有丝分裂：是体细胞增殖的主要方式，能保证亲子代细胞遗传物质的稳定性。
- 无丝分裂：过程简单，不出现纺锤丝和染色体，如蛙的红细胞。
- 减数分裂：与有性生殖有关，发生在原始生殖细胞产生配子的过程中。

细胞周期（Cell Cycle）是细胞从一次分裂完成开始，到下一次分裂完成为止所经历的全过程，是生物体增殖的基础。

细胞周期主要分为两个阶段：间期和分裂期（M 期）。

分裂间期 (Interphase)：占细胞周期的 90%~95%，是物质准备阶段。
- G1 期（前期生长期）：细胞进行正常的生长和代谢，合成大量的蛋白质和 RNA，增加细胞器的数量，为 DNA 复制做准备。
- S 期（DNA 合成期）：完成 DNA 的半保留复制，使染色体数量加倍，同时中心体也在此时期开始复制。
- G2 期（后期生长期）：细胞继续生长，合成有丝分裂所需的蛋白质（如纺锤体微管蛋白），并检查 DNA 复制是否完整。
分裂期 (M Phase)：过程较短，但变化剧烈，包括核分裂（有丝分裂）和胞质分裂。
- 有丝分裂：分为前期、前中期、中期、后期和末期，确保复制后的染色体精确分配到两个子核中。
- 胞质分裂：物理上将细胞质一分为二。动物细胞通过收缩环缢裂，植物细胞形成细胞板。
G0 期（静止期）：暂时或永久脱离细胞周期的细胞处于此阶段，如成熟的神经细胞或心肌细胞。

细胞周期受一套复杂的细胞周期控制系统精确调控，其核心是两类调节蛋白：

正向调节：
- Cyclins（细胞周期蛋白）：其浓度在周期内呈规律性升降。
- Cdks（细胞周期蛋白依赖性激酶）：必须与 Cyclin 结合并被磷酸化后才具有活性，从而磷酸化靶蛋白，推动细胞进入下一阶段。
负向调节：
- p53 蛋白：“基因组守门员”，检测 DNA 损伤，若无法修复则诱导细胞凋亡。
- Rb 蛋白：监控细胞大小和生长信号，在未受磷酸化时阻止细胞由 G1 期进入 S 期。
- Cdk 抑制蛋白（如 p21）：通过与 Cdk 结合使其失活，从而阻断细胞周期进展。

检查点是周期中的关键转换点，用于确保前一步骤完成后才开始下一步：

G1 检查点（限制点）：检查环境是否适宜、细胞大小是否达标以及 DNA 是否受损。通过此点后，细胞通常会完成整个周期。
G2/M 检查点：确保 DNA 已完全复制且无损伤，是进入有丝分裂的最后一道关卡。
M 检查点（纺锤体检查点）：发生在有丝分裂中期，检查所有染色体是否都已正确附着在纺锤丝上，防止染色体分配错误。

同步化是指通过实验手段使群体细胞处于细胞周期的同一阶段，便于研究。主要方法包括：

物理分拣法：如离心分离法，利用不同时期细胞体积和密度的差异进行分离。
化学阻滞法：
- DNA 合成抑制剂：如使用高浓度胸苷（Thymidine）将细胞阻断在 G1/S 转换处。
- 营养限制：如去除血清，使细胞停顿在 G1 期或进入 G0 期。

细胞增殖的意义与制约因素：

遗传意义：通过有丝分裂，亲代细胞的染色体经复制后精确地平均分配到两个子细胞中。由于染色体上有遗传物质 DNA，这保证了亲代与子代之间遗传性状的稳定性。
体积限制：细胞不能无限长大。原因包括：相对表面积限制，细胞体积越大，相对表面积越小，物质运输效率越低；核质比限制，细胞核中的 DNA 量有限，其控制代谢的能力有限。

细胞增殖是重要的细胞生命活动，是生物体生长、发育、繁殖、遗传的基础。（课本原话）

在细胞周期内，单个细胞的生长本质上是细胞成分（如蛋白质、大分子和细胞器）有序增加的过程，表现为细胞体积和质量的增大。

以下是细胞生长的几个核心细节：

物质转化：细胞通过不断从周围环境中吸收水分、无机盐、葡萄糖等营养物质，并将其转化为组成自身的结构（如形成新的细胞壁、细胞质和细胞膜等），从而使体积由小变大。
发生的阶段：生长主要发生在分裂间期。其中，G1 期是初级生长阶段，细胞会进行大量蛋白质合成和细胞器复制，使体积增加到原始大小的约两倍；而在 G2 期，细胞会继续合成一些蛋白质，为随后的分裂做准备。
植物细胞的特征：植物细胞在生长过程中，最显著的变化是液泡内细胞液不断增多，多个小液泡逐渐胀大并合并为一个中央大液泡。这会将细胞质挤成一薄层并紧贴细胞膜，使细胞核也随之移向一侧。
生长的极限：细胞不能无限长大，其大小受到以下因素的限制：
- 相对表面积限制：细胞体积越大，其表面积与体积的比值（相对表面积）越小，导致物质交换和信息传递的效率降低，无法支持庞大体积的代谢需求。
- 核质比限制：细胞核中的 DNA 含量不会随体积扩大而增加，当细胞过大时，细胞核对代谢和遗传的控制能力会达到极限。

当细胞生长到一定程度时，往往会通过细胞分裂将一个细胞分成两个，从而恢复较高的运输效率。

观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂

这项实验是高中生物学中非常经典且重要的探究活动。它通过对植物根尖分生区细胞的观察，让我们直观地理解细胞周期和有丝分裂的过程。实验原理与选材：

分生区特点：在高等植物中，根尖的分生区细胞具有旺盛的分裂能力。由于每个细胞的分裂是独立进行的，因此我们可以通过一个根尖样本观察到处于不同分裂时期的细胞。
染色原理：细胞核中的染色体（或染色质）容易被碱性染料（如甲紫溶液或醋酸洋红液）染成深色，从而方便在显微镜下辨识其形态。
选材：通常选用洋葱、大蒜或葱。选择细胞周期短、分裂期占比较大的材料更容易观察到分裂相。

制片的质量直接决定了观察效果，其核心流程是：解离 → 漂洗 → 染色 → 制片。

解离 (Dissociation)：质量分数 15% 的盐酸和体积分数 95% 的酒精（1:1 混合）。目的：用药液使组织中的细胞相互分离开来，并利用盐酸杀死细胞，将细胞固定在当下的分裂阶段。
漂洗 (Rinsing)：清水。目的：洗去残留的解离液，防止解离过度，更重要的是防止酸碱中和（因为染色剂是碱性的，酸会影响染色效果）。
染色 (Staining)：0.01 g/mL 或 0.02 g/mL 的甲紫溶液（龙胆紫）或醋酸洋红液。目的：使染色体（质）着色。
制片 (Mounting)：在载玻片上加清水，用镊子尖把根尖弄碎，盖上盖玻片后，需加盖一片载玻片并用拇指垂直按压。目的：使细胞分散开，形成均匀的单层薄层，避免细胞重叠。

显微镜下的观察与识别：

寻找目标：先在低倍镜下扫视，找到分生区。特征是细胞呈正方形，排列紧密。
识别时期：
- 分裂间期：看到的细胞最多，因为间期占细胞周期的 90%~95%。此时可见清晰的核膜和核仁。
- 前期：染色质缩短变粗成为染色体，核仁、核膜消失。
- 中期：染色体着丝粒整齐排列在赤道板上，这是观察染色体数目和形态的最佳时期。
- 后期：着丝粒分裂，子染色体分别移向两极，染色体数目暂时加倍。
- 末期：染色体变回染色质，核膜、核仁重建，中央出现细胞板并扩展为新的细胞壁。

关键讨论与分析：

为什么看不到细胞动态分裂？ 因为解离步骤已经杀死了细胞，显微镜下观察到的是停留在某一时刻的死细胞。
数据统计的意义：通过统计视野中各时期细胞的数量，可以推算各时期占细胞周期的比例。公式为：某时期的时间=细胞周期总时长\times(该时期细胞数 \div 计数细胞总数)。

这个实验需要非常耐心地操作和寻找。

二分分裂

二分分裂（Binary Fission）是原核生物（如细菌）和某些单细胞真核生物（如变形虫、草履虫）最常见的无性繁殖方式。

原核生物（如细菌）的二分分裂是真核细胞有丝分裂的进化来源。过程如下：

DNA 复制启动：细菌的基因位于单个环状染色体上。复制从特定的序列——复制起点（Origin of Replication）开始。
染色体移动与细胞生长：随着 DNA 的复制，两个复制起点迅速分开并移向细胞两端，细胞也随之伸长。
细胞质分裂：当 DNA 复制完成且细胞体积约增大一倍时，质膜向内凹陷。
形成子细胞：在亲代细胞中央形成隔膜，最终将细胞一分为二，产生两个遗传物质完全相同的子细胞。在理想状态下，大肠杆菌完成这一过程仅需 20-25 分钟。

在变形虫、草履虫等生物中，二分分裂略有不同：

核分裂：细胞核首先进行分裂。
胞质分裂：随后原生质体发生缢裂（Cleavage）。例如变形虫生长到一定时期，细胞核先分裂，然后细胞从中部的外周向内凹陷，缢裂成两个子体。

主要特征与意义：

简单高效：相比有丝分裂，二分分裂过程更简单，不涉及复杂的纺锤体结构或多条线性染色体的排布。
遗传稳定性：通常产生两个与亲代完全一致的等同子细胞，保证了物种遗传的连续性。
与多重分裂的区别：如果亲代细胞分裂产生多个子细胞，则称为多重分裂（Multiple Fission），这种细胞被称为裂殖体（Schizont）。

多重分裂（Multiple Fission），也称为复分裂，是指一个亲代细胞一次性分裂产生多个子代细胞的过程。这种繁殖方式在原生动物（如孢子虫纲的疟原虫）中非常典型。

具体的增殖过程如下：

核分裂：母细胞的细胞核首先进行多次重复分裂，在胞质分裂前产生大量的子核。
形成裂殖体：此时细胞处于多核状态，这种进行多重分裂的细胞被称为裂殖体（Schizont）。
胞质分割：随后，细胞质以这些子核为中心进行分割，使每个核都被一部分细胞质包围。
释放子细胞：最终，母细胞分裂成许多个（通常是等同的）子代个体并释放出来。

这种过程也被称为裂体生殖（Schizogamy）。除了疟原虫外，草履虫和变形虫在某些情况下也会表现出这种分裂方式。

无丝分裂

无丝分裂（Amitosis）是一种过程相对简单的真核细胞分裂方式。

基本特征：在分裂过程中，细胞内不形成纺锤丝，也不会出现染色质凝缩成染色体的现象，因此得名。尽管如此，细胞在分裂前仍会进行 DNA 的复制。
分裂过程：
1. 核延长：细胞核首先拉长，通常呈现哑铃形。
2. 核缢裂：核的中部向内凹陷并断开，形成两个子细胞核。
3. 胞质分裂：随后整个细胞从中部缢裂成两部分，最终产生两个子细胞。
典型实例：最著名的案例是蛙的红细胞。此外，这种分裂方式也存在于某些高等植物的胚乳细胞、根冠细胞，以及人体内某些高度分化的细胞（如部分肝细胞、肾细胞）中。
生物学意义：无丝分裂能让细胞在短时间内快速完成增殖。不过，目前多数科学家认为它并不是真核细胞一种正常的普遍分裂方式。

无丝分裂与有丝分裂在遗传物质分配的精确性上存在显著差异，主要体现在以下两个方面：

有丝分裂：高度精确。有丝分裂具有一套极其精密的分配机制。在分裂前，DNA 经复制形成两条完全相同的姐妹染色单体。分裂期通过形成纺锤体，牵引染色体整齐排列在赤道面上，并随后将姐妹染色单体精确地平均分配到两个子细胞中。这种机制确保了子代细胞与亲代细胞在遗传性状上的高度稳定性。
无丝分裂：随机且相对模糊。无丝分裂的过程非常简单。虽然在分裂前也会进行 DNA 复制，但在分裂过程中不出现染色体和纺锤丝。细胞核通常只是拉长并从中缢裂，随后细胞质一分为二。由于缺乏像纺锤丝这样精确牵引遗传物质的结构，其遗传物质的分配相对随机，精确度远不如有丝分裂。

简而言之，有丝分裂是“精准配给”，而无丝分裂更像是“粗略平分”。

有丝分裂和减数分裂

有丝分裂的过程

有丝分裂（Mitosis）是真核细胞增殖的主要方式，其核心是将亲代细胞的遗传物质精确地平均分配到两个子细胞中。有丝分裂并非时刻都在进行，它是一个有序循环的过程：

分裂间期 (Interphase)：占整个周期的 90%~95%。此时细胞表面平静，实则在内部进行繁重的物质准备，包括 DNA 的复制和相关蛋白质的合成，同时细胞体积适度增大。
分裂期 (M phase)：虽然用时短，却是染色体形态变化最剧烈的阶段。

为了便于记忆，我们可以把分裂期拆解为以下四步：

前期 (Prophase)：
- 染色体出现：细丝状的染色质高度螺旋化，缩短变粗成为染色体。
- 结构解体：核膜消失，核仁逐渐解体。
- 纺锤体形成：由中心体（动物）或细胞两极（植物）发出丝状物形成纺锤体。
中期 (Metaphase)：
- 整齐排列：染色体的着丝粒整齐地排列在细胞中央的赤道板上。
- 观察良机：此时染色体形态稳定、数目清晰，是计数和观察染色体的最佳时期。
后期 (Anaphase)：
- 着丝粒分裂：姐妹染色单体分开，在纺锤丝的牵引下向细胞两极移动。
- 数目加倍：由于染色单体变成了染色体，细胞内的染色体数目暂时加倍。
末期 (Telophase)：
- 结构重建：染色体重新解螺旋变回染色质，纺锤体消失，新的核膜、核仁出现。
- 细胞分裂：细胞质分裂，一个亲代细胞最终变为两个子细胞。

动植物细胞的“分家”虽然过程大体一致，但在两个环节上有显著不同：

纺锤体来源：动物细胞由中心体发出星射线；高等植物细胞由细胞两极直接发出纺锤丝。
胞质分裂方式：动物细胞在赤道面位置由细胞膜向内凹陷，缢裂成两部分；植物细胞在赤道面位置出现细胞板，并向四周扩展形成新的细胞壁。

有丝分裂的生物学意义：它保证了亲代和子代细胞之间遗传性状的稳定性。如果没有这种精确的分配，生命活动将因遗传信息的紊乱而无法持续。

有丝分裂中核 DNA、染色体、染色单体的数量及其变化

有丝分裂中的数量变化曲线是理解细胞增殖的核心。我们可以通过核 DNA、染色体和染色单体三个指标在细胞周期（2n=2N）中的变化来详细分析。

核 DNA 数量变化曲线：
- 变化规律：2n \to 4n \to 2n。
- 关键阶段分析：
  - 分裂间期：在 S 期进行 DNA 的复制，数量由 2n 逐渐增加到 4n。在曲线图中，这表现为一段斜线。
  - 前期、中期、后期：核 DNA 含量维持在 4n 不变。
  - 末期：随着细胞质分裂，一个亲代细胞一分为二，核 DNA 随之平均分配到两个子细胞中，回到 2n 水平。
染色体数量变化曲线：
- 变化规律：2N \to 4N \to 2N。
- 关键阶段分析：
  - 间期、前期、中期：虽然 DNA 完成了复制，但由于姐妹染色单体共用一个着丝粒，染色体数目仍为 2N。
  - 后期：着丝粒分裂，姐妹染色单体分开成为两条子染色体，导致细胞内染色体数目瞬间加倍（由 2N \to 4N）。在曲线图中，这表现为一个跳跃式的台阶。
  - 末期：细胞分裂成两个子细胞，每个子细胞获得的染色体数目恢复为 2N。
染色单体数量变化曲线：
- 变化规律：0 \to 4N \to 0。
- 关键阶段分析：
  - 分裂间期：在 S 期随 DNA 复制而产生，数量由 0 增加到 4N。
  - 前期、中期：每条染色体含有两条姐妹染色单体，总数为 4N。
  - 后期：着丝粒分裂后，姐妹染色单体消失（转变为染色体），数量瞬间降为 0。
  - 末期：数量维持为 0。

时期	核 DNA 含量	染色体数目	染色单体数目
间期	2n \to 4n	2n	0 \to 4n
前期	4n	2n	4n
中期	4n	2n	4n
后期	4n	4n	0
末期	4n \to 2n	4n \to 2n	0

总结：DNA 的加倍发生在间期（复制），染色体的加倍发生在后期（着丝粒分裂）；两者减半都发生在末期（细胞一分为二）。

胚胎与胚胎工程

胚胎的发育过程

像培育试管婴儿这样，对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体的技术称为胚胎工程。其操作的主要对象是生殖细胞、受精卵以及早期胚胎细胞。胚胎发育是胚胎工程的理论基础。那么，动物胚胎是如何发育的呢？虽然脊椎动物种类繁多，胚胎发育过程也存在差异，但其早期发育较为相似，分成受精、卵裂、桑椹胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。

以蛙为例，由于卵黄分布不对称，精子与卵结合之后形成的受精卵分为动物极（发育为外胚层）和植物极（发育为中胚层和内胚层）。受精卵形成后开始卵裂，先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但胚胎的总体积大致不变。受精卵分裂成 16 \sim 32 个细胞的阶段，称为桑椹胚。在这个阶段，动物极细胞的分裂频率会超越靠近植物极且含有较多卵黄的细胞群，形成中空的球状胚，称为囊胚。随后形成的原肠胚具有外胚层、中胚层与内胚层，这三种胚层在之后会分化出各种组织和器官，逐渐发育成胚胎。

科学家通过模拟自然受孕的过程，逐渐洞悉胚胎发育的每一环节。这些都为胚胎工程（embryo engineering）的核心技术 — —体外受精（in vitro fertilization）和胚胎移植（embryo transfer）等技术的发展奠定了必要的基础，也促进了动物胚胎工程的迅猛发展，拓展了胚胎工程的应用领域。

性成熟后，曲细精管内壁上的精原细胞形成初级精母细胞，每个初级精母细胞经过减数分裂形成 4 个精细胞，再经过分化（变形）过程形成精子，每个精子中都含有一个染色体组。精子的发生是依附在支持细胞上进行的，支持细胞为精子的发生提供营养，精子形成后进入曲细精管的管腔中。

哺乳动物卵细胞的发生是在雌性动物的卵巢中开始的。一个初级卵母细胞最终可能产生三个极体和一个卵细胞，它们的细胞中都含有一个染色体组。哺乳动物及其他许多脊椎动物的卵细胞发育在出生后会停止一段时间，直到雌性动物发育到性成熟期才继续发育。哺乳动物的初级卵母细胞经过减数分裂逐步形成成熟的卵子。减数第一次分裂是在排卵前完成的，排卵后，随着精子进入次级卵母细胞继续减数第二次分裂，一个次级卵母细胞分裂形成一个成熟的卵子和第二极体。雌、雄原核逐渐融合，形成受精卵。

当卵细胞质膜和透明带之间出现两个极体、雌雄原核融合时，表示受精作用已经完成，胚胎发育由此开始。哺乳动物的胚胎发育是指受精卵发育成幼体的过程，包括桑葚胚（morula）、囊胚（blastula）、原肠胚（gastrula）等主要发育阶段。

在人的胚胎发育中，受精卵一旦形成，便开始从输卵管移向子宫腔，在移动的同时，受精卵经过细胞分裂，形成囊胚并植入子宫内膜。从受精完成至第 1 周末为胚卵期。在这一时期，胚胎开始着床，囊胚进一步发育。
从第 2 周开始至第 8 周为胚胎期。囊胚植入子宫内膜过程中，囊胚壁逐渐发育为滋养层，内细胞团逐渐发育形成二胚层的胚盘，然后继续发育为三胚层的原肠胚。
从第 3 周开始，二胚层胚盘中的部分细胞增殖分化形成中胚层。随着三个胚层的分化，三胚层逐渐发育为各种器官的原基。胚盘发育为胚体，胚体凸入羊膜腔，浸泡在羊水中，胎盘逐渐形成。约在第 3 周末，心脏出现。
从第 4 周开始，三胚层逐渐发育，形成眼、耳、鼻等器官的原基；第 4 周末，神经系统开始发生；第 8 周末，各器官原基形成，胚体初具人形，胚胎期发育结束。
从第 9 周开始，进入胎儿期，各器官系统继续发育，多数器官逐渐出现不同程度的功能活动；从第 9 周到第 12 周，胎儿的头部仍占优势，躯体长高，脑部继续增长，眼睑闭合，眼内出现视网膜，从外生殖器可辨性别；从第 13 周到第 16 周，胎儿小脑变得突出，一般感觉器官分化，耳郭伸出，出现闭眼和吸吮的动作；从第 17 周到第 20 周，出现睫毛和眉毛，胎毛覆盖皮肤；21 周后，胎儿继续发育直至出生。

胚胎工程包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植等技术。体外受精是指哺乳动物的精子和卵在人工控制的环境中完成受精过程的技术。这一技术主要包括卵的采集及成熟培养、精子的采集与体外获能、卵与精子的体外受精等环节。体外受精在动物优良品种的繁育中发挥着极为重要的作用。胚胎移植是将早期胚胎移植到同种且生理状态相同的受体动物体内，使之继续发育成为新个体的技术。胚胎移植实际上是产生胚胎的供体和孕育胚胎的受体分工合作、共同繁育后代的过程。

胚胎工程的迅猛发展让人们大量繁殖优良家畜品种的愿望，正在成为现实。胚胎工程是指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。胚胎工程技术包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。胚胎工程的许多技术，实际上是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。因此，了解哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律十分重要。

受精是精子与卵子结合形成合子（即受精卵）的过程，包括受精前的准备阶段和受精阶段。在自然条件下，哺乳动物的受精在输卵管内完成。

精子获能：科学研究发现，刚刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在雌性动物的生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力，这一生理现象称为“精子获能”。通过对精子获能机制的研究，科学家找到了使精子在体外获能的方法，实现了各种哺乳动物精子在体外条件下的获能，为体外受精技术的建立奠定了重要基础。使精子获能的方法有直接利用雌性动物的生殖道使精子获能；将精子培养在人工配制的获能液中使其获能等。获能液的成分因动物种类不同而有所差异，常见的有效成分有肝素、\ce{Ca^2+} 载体等。
卵子的准备：卵子一般在排出 \pu{2 \sim 3 h} 后才能被精子穿入。动物排出的卵子成熟程度不同，有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等；有的可能是次级卵母细胞，如猪、羊等。但它们都要在输卵管内进一步成熟，到 M_{\text{II}} 期时，才具备与精子受精的能力。
受精阶段：获能后的精子与卵子相遇时，首先它释放出多种酶，以溶解卵细胞膜外的一些结构，同时借助自身的运动接触卵细胞膜。随之，精子的细胞膜与卵细胞膜融合，卵细胞膜外的透明带迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明带。精子入卵后，卵细胞膜也会立即发生生理反应，拒绝其他精子再进入卵内。精子入卵后，尾部脱离，原有的核膜破裂并形成一个新的核膜，最后形成一个比原来精子的核还大的核，叫作雄原核。与此同时，精子入卵后被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体后，形成雌原核。雄、雌原核充分发育后，相向移动，彼此靠近，核膜消失。这个含有两个染色体组的合子就是受精卵。受精过程结束后，受精卵的发育也就开始了。

多数哺乳动物的第一极体不进行减数分裂Ⅱ，因而不会形成两个第二极体。在实际胚胎工程操作中，常以观察到两个极体或者雌、雄原核作为受精的标志。受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂，开始发育。胚胎发育早期，有一段时间是在透明带内进行分裂，细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，这种受精卵的早期分裂称为卵裂。根据胚胎形态的变化，可将早期发育的胚胎分为以下几个阶段。

桑葚胚：当卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团，形似桑葚时，这时的胚胎称为桑葚胚。
囊胚：胚胎进一步发育，细胞继续分化。聚集在胚胎一端的细胞形成内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织；而沿透明带内壁扩展和排列的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。

随着胚胎的进一步发育，胚胎的内部出现了含有液体的腔—囊胚腔，这个时期的胚胎叫作囊胚。囊胚进一步扩大，透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程叫作孵化。孵化非常重要，如果不能正常孵化，胚胎就无法继续发育。囊胚孵化后，将发育形成原肠胚。原肠胚表面的细胞层为外胚层，向内迁移的细胞形成内胚层。随着发育的进行，一部分细胞还会在内、外两个胚层之间形成中胚层。这三个胚层将逐渐分化形成各种组织、器官等。

高等动物普遍的生殖方式是有性生殖，雌、雄生殖细胞结合成为受精卵标志着新生命的开始。鼠、牛和羊等哺乳动物的受精方式是体内受精，但新排出的精子不能立即使卵细胞受精，需要在雌性生殖道中发生一系列生理变化后，才具有受精能力，这一生理现象称为精子获能。获能后的精子耗氧量增加，迅速游向卵细胞并与之结合。精子的头部进入卵细胞后不久，精核就与卵核相遇，使彼此的染色体会合在一起，形成受精卵。

受精完成后，受精卵开始进行快速而有序的有丝分裂，这个过程叫作卵裂（cleavage）。由于卵裂期细胞分裂速度快，胚胎细胞来不及长大，下一次分裂就已开始，所以每个细胞越来越小，但胚胎总体积基本不变。当胚胎细胞达到 16~32 个左右时，形成了致密的细胞团，形似桑葚，叫作桑葚胚。

桑葚胚进一步分裂，胚胎内部形成空隙，逐渐发育成由内细胞团（inner cell mass）、滋养层细胞和囊胚腔构成的囊胚。囊胚中的内细胞团将发育成胎儿的各种组织，而滋养层细胞将发育成胎盘和胎膜。胚胎通过胎盘从母体中获得正常发育所需的氧气和营养物质等。

囊胚进一步发育，内细胞团的细胞不断分裂分化为 2 层细胞。靠近囊胚腔的一层细胞称为下胚层，位于下胚层和滋养层之间的细胞称为上胚层。上胚层的细胞继续分裂分化并迁入下胚层，逐渐置换了下胚层细胞，从而形成一层新细胞，称为内胚层。另一部分上胚层细胞继续分裂扩展，在上胚层和内胚层之间逐渐形成一层新细胞，称为中胚层。形成内胚层和中胚层之后，剩余的上胚层改称外胚层，这样就形成了由 3 个胚层构成的原肠胚。原肠胚的不同胚层之间相互作用，按各自的发育途径分裂和分化为相应的细胞和组织，为形成结构复杂的生命体奠定基础。

哺乳动物从受精卵到幼体的发育过程称为胚胎发育。根据胚胎形态的变化，早期胚胎的发育一般包括三个阶段：桑葚胚、囊胚和原肠胚。这些胚胎细胞还能像受精卵细胞一样发育成完整的个体吗？大量实验表明，在胚胎形成过程中，细胞的分化程度越高，全能性就越弱。尽管桑葚胚和囊胚的细胞在体积和数目上发生了很大变化，但是细胞的功能和发育潜能基本没有改变，分离开来的细胞团仍然可以独立发育成个体。而原肠胚的细胞由于分化程度较高，分割开的胚胎已经不能各自发育成一个新个体。胚胎形成过程中的这些特征为科学家对早期胚胎进行干预和改造提供了可能性。

胚胎分割技术

1942 年，科学家成功地对大鼠二细胞胚胎进行了分离和培养。后来，一些科学家尝试着把绵羊八细胞胚胎分割成 4 份，每份 2 个细胞，再将它们植入母羊子宫内，结果母羊成功地产下 4 只小羊。像这样，用机械方法将早期胚胎平均分割成二分胚、四分胚甚至八分胚，经培养后植入受体，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术称为胚胎分割（embryo bisection）技术。这种技术被视为一种胚胎克隆方法。胚胎分割常需要利用显微操作仪进行操作。在操作时，应选择形态正常、发育良好的桑葚胚或囊胚，在盛有操作液（含有质量分数为 10\% \sim 20\% 的血清）的培养皿中用分割针或分割刀片将胚胎切开。如果切割的是囊胚，一定要均等分割内细胞团；然后再将吸出的半个胚胎注入一个已经清空的透明带中或直接将其移植到受体中。

显微针分割法该法适用于卵裂球阶段的胚胎。操作时在显微操作仪下将胚胎固定，用显微针在透明带上做一切口，将卵裂球从透明带中移出，并吹吸卵裂球使之离散，将其装入 2 个预先准备好的空透明带内，进行移植。该方法具有较高的同卵双生率，但操作程序复杂。
显微刀分割法该法适用于对桑葚胚和早期囊胚进行分割。在显微操作仪下固定胚胎，用显微刀片将胚胎均匀地一分为二，分别装入空透明带中，进行移植。
酶软化透明带后显微分割法用质量分数为 0.5\% 的链霉蛋白酶溶液软化胚胎透明带。若是紧密化胚胎（如桑葚胚），则需在无钙、无镁的平衡盐溶液中处理 \pu{20 min}，使胚胎去紧密化。将胚胎固定，把针置于欲分割的胚胎上面，使其与胚胎呈 \pu{30 ^{\circ}}，对准胚胎的正中平分线徐余下压，即可将一个胚胎分割成两半。
酶消去透明带后显微分割法用质量分数为 0.25\% \sim 0.5\% 的链霉蛋白酶溶液消去胚胎透明带，然后用显微针或显微刀将裸胚一分为二。

胚胎分割技术不仅能使可供胚胎移植的胚胎数目成倍增加，而且可以产生遗传性能相同的后代。这对畜牧业生产和科学研究都有重要价值。例如，正常情况下，一头良种奶牛一生约可产犊 10 头，如用胚胎分割技术进行胚胎分割并移植到其他用作“寄母”的普通母牛子宫内，就可以获得大量的良种奶牛。在实际应用中，胚胎分割以二分胚的移植成功率最高。我国相继对猪、牛、马、绵羊、山羊、家兔和小鼠等动物进行了二分胚分割（图 2-4-6），并应用到胚胎移植中。

在动物研究的基础上，英国学者爱德华兹（R. Edwards）和斯特普托（C. Steptoe）最早开展了人类体外受精和胚胎移植技术的研究。1977 年，他们利用腹腔镜取卵，完成体外受精，并在受精卵发育到 8 细胞胚胎阶段移植入母体子宫内获得妊娠。1978 年 7 月，在英国剑桥大学诞生了世界首例“试管婴儿”。我国首例试管婴儿于 1985 年 4 月诞生于台湾。此后，人类的体外受精和胚胎移植技术得到了进一步的发展和应用，为部分生育困难患者带来了福音。

胚胎分割移植是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成几份，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术。进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，在显微镜下用分割针或分割刀进行分割。在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，还要特别注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

科学家们首先进行了大鼠卵裂球的分离和培养，随后又以小鼠为实验对象，获得了世界首例半胚来源的活体动物。经过多年的发展，胚胎分割移植在理论和技术方法上都已较为完善，尤其是对牛、羊等大型经济动物实施胚胎分割移植技术，可增加胚胎移植中的有效胚胎数、提高妊娠率，从而增加后代数量。与细胞核移植技术相比，胚胎分割移植具有更高的成功率。

胚胎分割：早期胚胎细胞具有很强的分裂能力，并保持着细胞全能性，能不能将一个胚胎分割成几份，从而提高胚胎的利用率？基于这样的设想，胚胎分割技术逐渐发展成熟。胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成 2 等份、4 等份或 8 等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可以看作动物无性繁殖或克隆的方法之一。胚胎分割所需要的主要仪器设备为体视显微镜和显微操作仪。在进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，将它移入盛有操作液的培养皿中，然后在显微镜下用分割针或分割刀分割。在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割。对于不同发育阶段的胚胎，分割的具体操作不完全相同。分割后的胚胎可以直接移植给受体，或经体外培养后，再移植给受体。经过 40 多年的发展，胚胎分割技术日趋成熟。这项技术可以促进优良动物品种的繁殖，产生的遗传性状相同的后代是进行遗传学研究的宝贵材料。此外，在胚胎移植前，进行性别鉴定、遗传病筛查等，对于人工控制动物性别、动物繁育健康后代具有重要意义。

1978 年，科学家将小鼠的桑葚胚一分为二，获得了成功。1979 年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。20 世纪 80 年代后，人们建立了系统的胚胎分割方法，并相继得到 1/4 和 1/8 分割胚胎的后代。我国的胚胎工程专家也进行了分割胚胎移植的实验研究，成功地对小鼠、家兔、绵羊、山羊和牛等动物进行了分割胚胎移植，并将二分胚胎分割技术应用到牛和羊的胚胎移植中。尽管胚胎分割技术已经在多种动物中取得成功，但仍存在一些问题，如刚出生的动物体重偏低，毛色和斑纹可能存在差异等。实践证明，采用胚胎分割技术产生同卵多胚的可能性是有限的，分割次数越多，分割后胚胎成活的概率越小。目前，仍然以二分胚胎的分割和移植效率最高，这成为提高家畜胚胎利用率的手段之一。

胚胎移植技术

胚胎工程是指对动物的胚胎进行人为操作和处理以获得目标个体的技术，包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等现代生物技术。精子和卵母细胞结合后，将受精卵移入相应的培养液中培养。培养液的基本成分包括维生素、氨基酸、蛋白质、无机盐和糖类等。待培养的胚胎发育到特定阶段后，再进行移植。像这样将良种雌性动物配种后，从其生殖道取出早期胚胎或通过体外受精及其他方式（如转基因、核移植）得到的受精卵或胚胎，再移植到同种的同时发情排卵但未经配种的其他雌性动物的体内，使它们进一步发育为新个体的技术，称为胚胎移植技术。

19 世纪末，科学家当时以兔为实验对象成功地完成了哺乳动物的胚胎移植。20 世纪 30 \sim 70 年代，胚胎移植成为当时生物学研究的主要方向之一，在多种家畜如绵羊、山羊、猪、牛和马上相继获得成功。20 世纪 60 年代后，科学家开始采用激素对供体进行超数排卵处理，并对受体进行同期发情处理。此后，胚胎移植技术发展迅猛，成为畜牧业中广泛使用的一种技术。胚胎移植实际上是产生胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程。这一技术又被形象地称为“借腹怀胎”。动物胚胎移植过程一般分为供体和受体的选择、供体和受体同期发情处理、供体的超数排卵处理和受精、胚胎收集以及胚胎移植。

胚胎移植作为胚胎工程中的一项技术具有重要的应用价值。例如，胚胎移植能发挥优良母畜的繁殖能力，迅速扩大优良畜种数量，加速优良畜种的推广应用；能缩短世代间隔，提高家畜改良速度；能长期保存冷冻胚胎，便于优良品种的种质运输和保存。同样，胚胎移植也使胚胎分割和核移植等技术成为基础生物学研究的重要手段。

胚胎移植是指将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体叫“受体”。通过任何一项技术（如转基因、核移植和体外受精等）获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。以牛的胚胎移植为例，胚胎移植主要包括供体、受体的选择和处理，配种或人工授精，胚胎的收集、检查、培养或保存，胚胎的移植，以及移植后的检查等步骤。

进行胚胎移植的优势是可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。在这项技术中，供体的主要职能变为产生具有优良遗传特性的胚胎，繁重而漫长的妊娠和育仔任务由受体取代，这就大大缩短了供体本身的繁殖周期。同时，在对供体施行超数排卵处理后，可获得多枚胚胎，经移植可得到多个后代，这使供体的后代数是自然繁殖的十几倍到几十倍。超数排卵是指应用外源促性腺激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。

体外受精技术

通过人工操作使卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植产生的个体。体外受精技术是提高动物繁殖能力的有效措施，还可以为胚胎移植提供可用的胚胎。在这个过程中，首先要做的就是体外受精。哺乳动物的体外受精技术主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养和获能处理，然后才能用于体外受精。一般情况下，可以将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精。

采集一定发育阶段的精子和卵母细胞是实施体外受精技术的重要环节。体外受精技术是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。其基本原理是人工模拟体内环境，包括营养、温度、\pH 等，促使卵母细胞成熟，同时使精子获能，最终完成受精作用等。这项技术现已日趋成熟，成为一项重要而常规的动物繁殖技术。体外受精技术包括采集精子、采集卵母细胞和体外受精等主要步骤。

采集精子采集动物精子的方法主要是假阴道法。假阴道通过模仿发情的雌性动物在交配时阴道的压力、温度和润滑度等条件，创造了适合采精的环境。采精者可手持假阴道，利用假台畜让被采精动物在模拟交配时将精液射入假阴道内，从而达到采集精子的目的。采集的精子可以立即使用或冷冻保存待用。由于精液中含有精子获能的抑制因子，冷冻液中还含有防冻剂等成分，精液中含有一定量的死精子，一般需要分离并获取有活力的精子。

采集卵母细胞采集卵母细胞的方法主要有抽吸法、机械破碎法等。采集较大型的动物如牛、猪的卵母细胞时，一般采用抽吸法。这是一种从活体卵巢中采集卵母细胞时的常用方法。技术人员操作时借助超声波探测仪和内窥镜等进行，将注射器针头刺入卵泡中一并吸出卵泡液和卵母细胞，再在显微镜下进行筛选。该方法的优点是可以有目的地选择卵泡，分离得到适当成熟程度的卵母细胞。活体采卵对于充分发挥优良母畜的繁殖潜力具有一定意义。采集较小型的动物如小鼠、兔的卵母细胞时，一般采用机械破碎法。这是一种从宰杀后的雌性动物卵巢上采集卵母细胞的方法。技术人员操作时，将刚宰杀的雌性动物体内摘出的卵巢置于培养皿中，用针头刺破卵巢和卵泡，再在显微镜下对卵母细胞进行筛选。该方法的优点是可以得到各种成熟程度的卵母细胞，缺点是在刺破卵巢和卵泡的过程中有可能刺伤卵母细胞。对于较小型的动物，还可以采用促性腺激素处理的方法，使其超数排卵，这样获得的卵母细胞可以直接与获能后的精子进行体外受精。如果采集到的卵母细胞尚未成熟，需通过体外培养使之成熟。经过体外培养后，一般要通过相关的形态观察指标（如 \pu{7 d} 后的囊胚发育率）对卵母细胞的体外成熟情况进行评价。

人卵泡的发育人卵泡的形成和在卵巢中的储备是在胎儿期完成的。人的胚胎性别分化后，雌性胎儿卵巢内的卵原细胞经过有丝分裂增加其数量，其中部分卵原细胞发育为初级卵母细胞。由于它们被卵泡细胞所包围，一般称之为卵泡。新生儿（女性）出生时卵巢内约有 15 万 \sim 50 万个卵泡。青春期以后，卵泡逐渐减少，女性一般只有 300 \sim 400 个卵泡能发育成熟，其余卵泡均发育到一定程度即自行退化。有些哺乳动物和人一样，卵泡的发育也始于胚胎时期。一般认为，哺乳动物出生后卵巢内卵泡不可更新，但仍有科学家在不断研究卵巢中是否存在生殖干细胞。这可能对生殖医学以及干细胞研究等具有深远意义。

体外受精哺乳动物的交配往往发生于发情的开始或发情盛期，排卵则发生于发情结束前后，这既保证了精子能先于卵母细胞到达受精部位，也给精子留了充足的获能时间。精子获能后发生膜流动性的增加、膜对 \ce{Ca^2+} 通透性提高、胞内环磷酸腺苷（cAMP）浓度的升高、表面电荷降低以及游动方式等一系列变化，其重要意义在于增强了精子的代谢能力和运动能力。获能后的精子会引起 \ce{Ca^2+} 内流到精子内，同时伴随精子细胞质膜通透性的改变和胞内 \pH 升高，刺激顶体反应的发生。顶体反应主要发生在精子头部。精子与卵子利用各自表面的特异性蛋白进行识别后，发生特异性结合。精子头部前端与卵母细胞透明带接触后，顶体外膜与精子头部的细胞质膜融合，顶体破裂释放出的顶体酶溶解卵母细胞周围的放射冠和透明带，精子即可穿过透明带到达卵母细胞表面。随着精子进入卵母细胞，雄原核与雌原核融合，最终形成受精卵。

家兔、猪等动物的精子，放入人工配制的获能液中，经培养即可获能；牛、羊等动物的精子，可放入一定浓度的肝素或相应的 \ce{Ca^2+} 载体溶液中，诱导精子获能。在人为控制的适宜条件下和专用的受精溶液中，获能的精子和培养成熟的卵母细胞放在一起培养一段时间，可以在体外完成受精过程。

日趋成熟的体外受精技术可用于研究哺乳动物生殖细胞的发生、受精和早期胚胎发育机制等。在家畜品种改良探索过程中，体外受精技术为胚胎生产提供了经济而高效的方法，对充分利用优良种质资源、缩短家畜繁殖周期、加快品种改良速度等具有重要价值。

植物细胞工程

什么是细胞工程

生物技术是应用生命科学的研究成果，对生物或生物的成分、产物等进行改造和利用的技术。生物技术是一个综合性的技术体系，我们可以将它与工程学原理相结合，来进行研究、设计和加工生产，为社会提供服务。细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。

在细胞学说的基础上，德国植物学家哈伯兰特（G. Haberlandt）于 1902 年提出了植物细胞具有全能性的假设，即离体的植物细胞在合适的条件下能够发育成为完整的植株。遗憾的是，受到当时技术和设备条件的限制，哈伯兰特没能证实自己的假设。1958 年，美国科学家斯图尔德（F. C. Steward）经过十几年的艰苦探索，用野生胡萝卜的根韧皮部组织通过组织培养的方法培育出具有根、茎、叶的完整植株。1965 年，科学家再用分离出的单个胡萝卜细胞进行培养，也实现了整株植株的再生。从哈伯兰特提出植物细胞全能性的假设，到这一假设得到科学实验的证实，经过了半个多世纪。

时间	内容
1902 年	哈伯兰特提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功。
1958 年	斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1960 年	科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1964 年	古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
1971 年	卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
1974 年	土壤农杆菌的 Ti 质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。

我们已经知道，分化后的细胞虽然在形态、结构与功能上与最初的受精卵存在着显著差异，但仍包含着与受精卵相同的遗传信息。在一定的条件下，分化后的细胞重新获得类似于胚胎细胞一样的分裂和分化能力的过程称为脱分化（dedifferentiation）。脱分化后的细胞经过细胞分裂，会形成无组织结构的、松散的细胞团，即愈伤组织。愈伤组织在一定条件下可以重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整的植株，这个过程称为再分化（redifferentiation）。

基于植物细胞的全能性理论，将离体的植物细胞、组织或器官（外植体）在适宜的培养条件下经脱分化形成愈伤组织，然后经过再分化，形成芽、根并最终发育成完整植株，这一过程称为植物组织培养。在植物组织培养中，细胞的脱分化和再分化是两个关键步骤。多种内部因素（如植物遗传性状和生理状况等）和外部因素（如营养和环境条件等）会影响这两个步骤。在这些影响因素中，生长素和细胞分裂素的浓度比例起着关键作用，它们对愈伤组织的生长和分化产生不同的影响。

细胞工程的基本原理

细胞是生物体结构和功能的基本单位，多细胞生物的生命起点通常是一个受精卵。在从受精卵发育为成熟个体的过程中，细胞经历了增殖、分化、衰老和死亡等一系列复杂的生命进程。以下是关于细胞分化、基因选择性表达及各种潜能性的详细讲解：

一、细胞的分化（Cell Differentiation）：细胞分化是多细胞生物发育的核心过程，它增加了细胞的种类，使生物体能够形成复杂的组织和器官。

定义：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。
特点：
- 持久性：细胞分化贯穿于生物体的整个生命进程中，但在胚胎时期达到最大限度。
- 稳定性和不可逆性：在自然状态下，分化后的细胞通常会一直保持分化后的状态，直到死亡，不会逆转回到未分化状态。
- 普遍性：它是生物界普遍存在的生命现象，是多细胞生物个体发育的基础。
- 遗传物质不变性：分化后的细胞与受精卵相比，细胞核内的遗传物质（DNA）保持不变。
意义：细胞分化使多细胞生物体中的细胞趋向专门化，有利于提高生物体各项生理功能的执行效率。例如，红细胞专门负责运输氧气，心肌细胞专门负责心脏搏动。

二、基因的选择性表达（Selective Gene Expression）：基因的选择性表达是细胞分化的根本原因和分子基础。

基本原理：尽管同一生物体的所有体细胞都含有相同的基因组（即相同的“蓝图”），但在不同的细胞中，基因的表达情况不同。
基因分类：
- 持家基因 (Housekeeping genes)：在所有细胞中都表达，其产物是维持细胞基本生命活动所必需的，如呼吸酶基因、核糖体蛋白基因、ATP 合成酶基因。
- 奢侈基因 (Luxury genes)：只在特定的细胞中特异性表达，决定细胞的特殊形态和功能，如红细胞中的血红蛋白基因、胰岛细胞中的胰岛素基因。
调控机制：这种选择性表达受到精密的调控，包括转录水平（主导）、转录后、翻译及翻译后等多个层次。
表观遗传 (Epigenetics)：基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象。常见的修饰方式包括 DNA 甲基化（抑制表达）和组蛋白修饰。

三、细胞的全能性（Cell Totipotency）：细胞的全能性描述了已分化的细胞重新发育成完整个体的潜能。

定义：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性。
原因：细胞核内含有本物种全套的遗传物质，拥有发育成完整个体所需的全套指令。
全能性大小：受精卵（最高）> 生殖细胞（如卵细胞）> 体细胞。通常分化程度越低，全能性越高。
实例：1958 年斯图尔德利用胡萝卜韧皮部细胞培养出完整植株，证实了高度分化的植物细胞具有全能性。在动物中，受精卵及早期胚胎细胞（如 4 或 8 细胞期之前）被认为具有全能性。

四、细胞核的全能性（Nuclear Totipotency）：对于高度分化的动物体细胞，由于细胞内物质的限制，目前尚无法直接将其培养成新个体，但其细胞核仍保留全能性。

定义：已分化的动物体细胞核，通过核移植技术进入去核卵细胞后，能指导并形成完整新个体的潜能。
经典证据：
- 戈登实验：1958 年戈登将非洲爪蟾小肠上皮细胞核移植到去核卵细胞中，成功培育出蝌蚪。
- 克隆羊多莉：1996 年利用高度分化的乳腺细胞核移植成功培育出克隆羊，有力证明了哺乳动物分化体细胞核的全能性。
- 克隆猴：我国科学家于 2017 年成功获得体细胞克隆猴“中中”和“华华”。

五、细胞的多能性（Cell Pluripotency）：多能性介于全能性和专能性之间，是干细胞研究中的重要概念。

定义：细胞具有分化成多种类型细胞的能力，但已失去了发育成完整个体的潜能。
多能干细胞 (Pluripotent Stem Cells)：
- 胚胎干细胞 (ES 细胞)：源自早期胚胎内细胞团，能分化成人体所有 3 个胚层（内、中、外胚层）的各类细胞（约 200 多种），但不能形成胎盘等胚外组织。
- 造血干细胞：虽然在某些分类中被视为多能干细胞，但更多时候被归类为“亚多能”或专向干细胞，因为它们主要分化为各种血细胞（红细胞、白细胞、血小板等）。
诱导多能干细胞 (iPS 细胞)：通过将特定的转录因子转入成体体细胞（如皮肤成纤维细胞），使其“去分化”逆转回到类似胚胎干细胞的多能状态。这一技术突破不仅解决了伦理争议，也为个性化医疗提供了可能。

植物细胞工程的原理

**细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。**但是，在生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全能性，比如，芽原基的细胞只能发育为芽，叶原基的细胞只能发育为叶。这是因为在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。这些离体培养的植物器官、组织或细胞被称为外植体。

植物细胞一般具有全能性。在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化，即失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞，进而形成不定形的薄壁组织团块，这称为愈伤组织。愈伤组织能重新分化成芽、根等器官，该过程称为再分化。植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上，就可以诱导其再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株。

在体细胞诱导形成愈伤组织之后，培养基中生长素 / 细胞分裂素的相对比例会决定愈伤组织的再生方向。这一经典理论最早由 Skoog 和 Miller 提出：
- 生长素 / 细胞分裂素比值高（即生长素相对多、细胞分裂素相对少）：有利于根的形成（根器官发生）。
- 生长素 / 细胞分裂素比值低（即细胞分裂素相对多、生长素相对少）：有利于茎芽的发生（芽器官发生）。
- 两者比例适中（相对平衡）：更倾向维持愈伤组织、促进细胞增殖而不分化。
这一规律在组织培养的实际操作中体现为分段培养法：先用相对「居中」的激素组合诱导愈伤增殖（CIM），再将比例调到细胞分裂素占优势以诱导不定芽（SIM），最后调到生长素占优势以促根发生（RIM）。需要注意的是，绝对浓度也很关键——同样 10 : 1 的比值，(10\;\pu{mg/L} : 1\;\pu{mg/L}) 与 (0.1\;\pu{mg/L} : 0.01\;\pu{mg/L}) 对细胞的影响截然不同。此外，不同基因型、取材部位的内源激素背景也会「抵消或叠加」外源配方的效果，因此具体比例需根据植物种类和培养条件动态调整。
植物细胞外面有一层细胞壁，这层细胞壁阻碍着细胞间的杂交。因此，在进行体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除这层细胞壁，获得原生质体。杂交过程中的一个关键环节，是原生质体间的融合，这必须要借助一定的技术手段才能实现。人工诱导原生质体融合的方法基本可以分为两大类—物理法和化学法。物理法包括电融合法、离心法等；化学法包括聚乙二醇（PEG）融合法、高 \ce{Ca^2+}—高 \pH 融合法等。融合后得到的杂种细胞再经过诱导可形成愈伤组织，并可进一步发育成完整的杂种植株。
**植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。**利用这项技术，科学家培育出了白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃麦草等杂种植株。植物体细胞杂交技术在打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势。

植物细胞工程的应用

植物细胞工程在农业、医药工业等方面有着广泛的应用，并且取得了显著的社会效益和经济效益。

快速繁殖：将优良植株的茎尖或叶片等器官进行离体培养，在短时间内可以获得大量遗传性状一致的植株，这种技术称为植物快速繁殖技术。继兰花的快速繁殖实现后，该技术得到了快速发展，其适用对象从最初的观赏植物逐渐发展到果树、林木、蔬菜和田间作物。现已有上千种植物可通过组织培养技术进行快速繁殖。我国科学家屠呦呦团队还利用组织培养技术，建立了青蒿国家种质资源库，用于检验不同种质资源的青蒿素含量、耐旱性、抗病虫害等指标，以便寻找出更优质的品种。
作物脱毒：利用植物组织培养技术还可以进行植物脱毒（即降低或去除病毒对植株的感染）。目前已知可以感染植物的病毒有数百种，受到感染的植株通常会出现病斑，其正常生长受到严重影响。绝大多数的病毒是通过植物体内的维管组织传播的，而位于种子植物胚珠中央的珠心组织与周围其他组织没有维管联系，因此通过珠心组织培养可以获得无毒植株。此外，通过离体培养分裂旺盛的茎尖也可以脱除植物病毒。
种质保存：植物细胞全能性的发现和证实还为植物种质资源的长期保存开辟了一条新途径。许多植物的组织培养物在液氮中超低温保存以后，仍能保持很高的存活率而再生出新植株，并保持原来的遗传特性。例如，胡萝卜和烟草的悬浮细胞超低温保存 6 个月以后仍然能恢复生长并分化出植株。超低温保存的植物材料，可以是植物的悬浮细胞，也可以是愈伤组织或胚状体，还包括原生质体、花粉、幼胚、芽或茎尖分生组织等。超低温保存植物材料的原理与保存动物材料的原理一样，在 -196℃ 的条件下，活细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止，细胞、组织、器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丧失形态发生的潜能。在植物自然资源受到过度开发和严重破坏的情况下，利用人工种质库长期保存珍稀的濒危植物更加迫在眉睫。同时，这样的方法比保存植物的种子更为有利和经济，还能在需要的时候迅速且大量地繁殖植物。
单倍体育种：常规选育出一个可以稳定遗传的作物优良品种，一般要经过 5 \sim 6 年的连续筛选。而单倍体育种可以先通过花药（或花粉）培养获得单倍体植株，然后经过诱导染色体加倍，当年就能培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株，这极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力和物力。单倍体育种已成为作物育种的一条有效途径。此外，由于大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现，因此它也是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。

20 世纪 20 年代，科学家首次在自然界发现高等植物曼陀罗的单倍体植株，它与正常二倍体植株相比，叶小、株矮、生存能力弱且高度不育。但是，单倍体的发现对如何在育种中缩短育种周期、获得纯系植株等具有重要意义。通过常规的杂交育种（cross breeding）方法培育新品种，一般需要花费较长时间才能筛选出具有稳定遗传特性的新品种。而通过单倍体育种（haploid breeding）方法培育新品种，可以大大缩短育种的时间，且可以获得具有稳定遗传特性的优良品种，节约了人力物力。单倍体的诱导与利用是植物细胞工程成功应用的典型范例。单倍体的育种思路是，先通过培育小孢子，获得单倍体植株幼苗，再诱导其染色体数目加倍，从而获得纯合二倍体植株。

成熟的花药由花药壁和花粉囊及其中的花粉等结构组成。经过适当的诱导，花粉囊中的花粉可发育成单倍性的胚状体或愈伤组织，最终形成单倍体植株。在诱导单倍体植株的某些阶段（如形成愈伤组织时期或幼胚时期），一般用质量分数为 0.02\% \sim 0.4\% 的秋水仙素溶液处理 \pu{2 \sim 3 d}，然后按常规途径培养，就可能获得染色体数目加倍的，能正常生长发育并开花、结果的二倍体植株。

高中教材常将「单倍体」简化为「只含一套染色体组」，但在多倍体物种中，这种说法会产生混淆。学术上严格区分两个概念：

单倍体（haploid）：指含有该物种配子染色体数 n 的个体，强调的是「来源」——由配子直接发育而来。它含有几套染色体组，取决于原物种的倍性。
一倍体（monoploid）：指只含一套基本染色体组（基数 x）的个体，强调的是「数量」。

在二倍体物种中，n = x，两者没有区别（如人的单倍体即一倍体，n = x = 23）。但在多倍体物种中，n \neq x，两者不再等价。

n 与 x 的关系

2n：体细胞染色体数，不直接等于倍性（在多倍体中 2n 可能等于 4x、6x 等）。
n：配子染色体数，即减数分裂后的「还原数」。
x：基本染色体数，即一套完整染色体组的条目数。

倍性（几倍体）用 x 来描述（如 2x 二倍体、4x 四倍体），单倍体用 n 来描述。混淆两者是考试中常见的错误来源。

用字母法理解不同倍性，以基因组字母（A、B、C 等）表示不同的基本染色体组：

类型	基因组式	倍性	体细胞 (2n)	配子 (n)	单倍体
二倍体	AA	2x	2x	x（即 A）	含 x，与一倍体相同
同源四倍体	BBBB	4x	4x	2x（即 BB）	含 2x，不等于一倍体
异源四倍体	BBCC	4x	4x	2x（即 BC）	含 2x，不等于一倍体

秋水仙素通过抑制纺锤体形成、阻断后期分离，导致染色体组加倍：

一倍体（x）加倍 → 二倍体（2x）
二倍体（2x）加倍 → 四倍体（4x）
同源四倍体的单倍体（n = 2x，即 BB）加倍 → 回到四倍体（4x，即 BBBB）

因此，「单倍体用秋水仙素处理后得到的倍性」取决于原物种的倍性背景：可能是二倍体，也可能是四倍体，不能一概而论。

植物「杂种细胞」与动物「杂交细胞」的术语差异？在体细胞融合技术中，植物和动物使用了不同的术语：

植物体细胞杂交：得到的是杂种细胞。由于植物细胞具有较强的全能性，融合细胞可以进一步再生为杂种植株，因此用「杂种」暗示最终可以得到个体层面的新品种。
动物细胞融合：得到的是杂交细胞。由于动物体细胞在体外难以恢复全能性（通常只能停留在细胞系阶段），因此用「杂交」表示细胞层面的融合，不暗示能得到杂种动物个体。

需要注意的是：术语的使用基于该技术的常规应用目标和生物学特性，不应根据实验「进行到哪一步」来主观替换。植物融合产物无论是否再生出植株，都称为杂种细胞；动物融合产物则统称为杂交细胞。

生产次生代谢产物：植物细胞除了能诱导形成完整植株外，还能像微生物一样在生物反应器里进行大规模的悬浮培养，用于生产重要的植物次生代谢产物。次生代谢产物是一类细胞生命活动非必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。

初生代谢是生物生长和生存所必需的代谢活动，因此在整个生命过程中它一直进行着。初生代谢物有糖类、脂质、蛋白质和核酸等。次生代谢不是生物生长所必需的，一般在特定的组织或器官中，并在一定的环境和时间条件下才进行。植物代谢会产生一些一般认为不是植物基本的生命活动所必需的产物—次生代谢物。次生代谢物是一类小分子有机化合物（如酚类、萜类和含氮化合物等），在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。

由于植物细胞的次生代谢物含量很低，从植物组织提取会大量破坏植物资源，有些产物又不能或难以通过化学合成途径得到，因此人们期望利用植物细胞培养来获得目标产物，这个过程就是细胞产物的工厂化生产。植物细胞培养是指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术。它不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，因此对于社会、经济、环境保护具有重要意义。

例如，紫杉醇是红豆杉属植物中的一种次生代谢产物，它是迄今为止发现的最好的天然抗癌药物之一。红豆杉属植物树皮中紫杉醇的含量极低，而且树种生长缓慢。通过剥树皮来提取紫杉醇，会导致红豆杉大量死亡。所以，紫杉醇的产量受到很大限制。为了满足市场对紫杉醇的大量需求，同时减少对自然资源的破坏，科学家们正在尝试各种技术路线。其中，植物细胞培养技术可以解决这一难题。通过对红豆杉细胞的悬浮培养，可以从中分离出高纯度的紫杉醇。

突变体的利用：在植物的组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断增殖的状态，因此它们容易受到培养条件和诱变因素（如射线、化学物质等）的影响而产生突变。从产生突变的个体中可以筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。

在植物组织培养中，常用的表面灭菌顺序是「酒精 → 无菌水 → 次氯酸钠 → 无菌水」。这个顺序有其科学道理：

70% 酒精：主要作用是破坏细菌和真菌表面蛋白、脂膜，同时溶解植物表面的蜡质和油脂，降低表面张力，让后面的消毒液更容易铺开。因此酒精常像「前处理」，起到「破防」的作用。
第一道无菌水：把残留酒精带走，避免酒精继续伤组织，尤其是嫩材料。
次氯酸钠：这是主要的表面消毒步骤，释放有效氯，杀菌、杀真菌孢子通常比短时酒精更彻底。
最后的无菌水：必须重视的一步，因为次氯酸钠残留会继续氧化、灼伤外植体，所以一般不是洗一次，而是洗几次把它尽量洗净。

第一个无菌水步骤在很多常规方案中可以省掉，尤其是酒精处理时间很短、材料比较耐受时。但对较嫩、较薄、较容易褐变的材料，这一步保留往往更稳妥。

两个消毒剂不能颠倒顺序。酒精放前面有「去蜡、润湿、开路」的作用，能帮助次氯酸钠更均匀接触表面；次氯酸钠放前面，这个优势就没了。

试管苗移植前的锻炼（炼苗）：试管苗移植到大田前的锻炼期，在农业和生物技术领域被称为「炼苗」（Hardening 或 Acclimatization，也叫驯化）。这是整个植物组织培养中最危险、死亡率最高的一个环节。

为什么试管苗不能直接下地？试管苗就像在「ICU 保温箱」里长大的早产儿，它的生理结构完全是为了适应试管内的极端安逸环境而发育的：

温室里的花朵（无角质层）：试管里湿度接近 100%，为了吸收环境里的水分，试管苗的叶片表面几乎没有蜡质的角质层。一旦直接暴露在空气中，几十分钟内就会脱水干枯。
无法闭合的嘴巴（气孔失效）：因为试管内湿度恒定，试管苗叶片上的气孔处于「长开不闭」的状态，气孔的保卫细胞缺乏收缩能力，遇到干旱根本不知道关门保水。
饭来张口（异养为主）：培养基里加了蔗糖，试管苗主要是靠「吃糖」长大（异养/兼养），它的叶绿体发育不完善，光合作用能力极弱（自养能力差）。
畸形的脚（水生根）：扎在琼脂里的根缺乏根毛，且内部导管发育不良，无法在致密的土壤中有效吸水。

炼苗的标准操作流程？炼苗是一个循序渐进的「断奶」过程，通常分为四个阶段：

瓶内炼苗：将培养瓶从恒温恒光的培养室搬出，放到温室或自然光下（但要避免阳光直射，用遮阳网）。几天后，稍微松开瓶盖，让外界空气进入瓶内。让植物逐渐适应外界波动较大的昼夜温差和更强的光照，刺激叶绿素的合成；降低瓶内湿度，给气孔保卫细胞「施加压力」，逼迫它们开始学会开闭。
出瓶与「洗澡」：将苗从瓶中小心拔出，必须放入温水或清水中，极其彻底地洗净根部附着的琼脂培养基。培养基里含有大量的糖分和营养，如果带有琼脂下地，土壤里的霉菌和细菌会立刻把这些糖分当成大餐，疯狂繁殖，瞬间导致试管苗根部腐烂。
无土基质中的高湿过渡：刚出瓶的苗绝对不能直接种到泥土里。必须种在经过消毒的、透气保水的轻型无土基质中（如：泥炭土 + 珍珠岩 + 蛭石的混合物）。种好后必须马上浇透水，并覆盖透明塑料薄膜，保持相对湿度在 85\% \sim 95\% 之间。
揭膜与控水：过了几天后，开始每天在小拱棚薄膜上戳洞，或者每天掀开薄膜通风两小时，逐渐增加通风时间。最后完全撤掉薄膜。湿度下降和光照增强会逼迫叶片表面快速分泌蜡质，形成厚厚的角质层；气孔完全恢复正常的开闭功能；控水非常关键：表层缺水会逼迫植物的根系努力向基质深处扎去，并在新长出的根上长出大量的根毛。

植物体细胞杂交中细胞核的融合：在植物体细胞杂交技术中，当两个原生质体融合后，最先发生的是细胞膜的融合和细胞质的混合。此时，细胞里会同时存在两个互相独立的细胞核，这被称为异核体（Heterokaryon）。那么，这两个核是怎么变成一个核（杂种核）的呢？

答案是：这两个细胞核通常并不是像两个肥皂泡那样「直接贴在一起然后融合成一个大泡」，而是通过一场精密的「拆解再重组」过程来完成融合的。这个过程发生在融合细胞的第一次有丝分裂期间：

相互靠近：原生质体融合后，在细胞骨架的牵引下，两个细胞核会逐渐向细胞中央移动，并紧紧地靠在一起。
「对表」与同步化：两个细胞核共享同一个细胞质环境，细胞质中的各种信号蛋白会强迫它们将细胞周期调整到同一步伐。
核膜瓦解与染色体会师：进入第一次有丝分裂的前期/前中期，两个细胞核的核膜同时开始解体，两个核里的染色体完全暴露在同一个细胞质中，并混合在一起。
重新建群：在细胞的两极，新的核膜开始围绕着混合了双亲遗传物质的染色体重新组装，形成真正的杂种核（Synkaryon）。

植物体细胞杂交技术

植物体细胞杂交又称为植物原生质体融合，是指将不同来源的植物细胞在一定条件下融合形成杂合细胞，并使之分化再生，最终形成新植物体的技术。例如，白菜和甘蓝是两种蔬菜，存在种间生殖隔离。育种专家借助植物体细胞杂交技术培育出了白菜—甘蓝这一新品种。与动物细胞不同的是，植物细胞外周覆盖着一层致密而坚硬的细胞壁，这会阻碍细胞之间的融合。因此，为了实现两种不同植物体细胞的融合，首先需要去除细胞壁以制备原生质体（即去除了细胞壁的细胞）。常见的原生质体制备方法包括机械分离或酶解分离，其中酶解分离法使用更为广泛。

制备的原生质体可以通过物理或化学方法诱导其融合。诱导植物原生质体融合的物理方法中，使用比较普遍的是电融合法；化学方法中，使用最广泛的是用聚乙二醇（PEG）促融。此外，还可以使用盐类融合法、高钙离子浓度与高 pH 组合促融法、PEG 与高钙离子浓度和高 pH 组合促融法。

图 2-10 中箭头所示是一个成功融合后的杂合细胞，这一细胞既包含来自叶片细胞的叶绿体，也包含来自花瓣细胞的红色液泡。由于诱导操作对于细胞融合没有选择性且融合效率并不高，因此，除了形成不同类型的融合细胞外，还会存在大量未融合的细胞，这就需要使用一系列的方法将发生了融合的杂合细胞筛选出来，并对其进行细胞学和生化分析鉴定。

经筛选和鉴定过的融合细胞，可通过植物组织培养技术获得新植株。植物体细胞的杂交可以避开生殖细胞的受精过程，在亲缘关系较远的物种之间实现遗传物质的融合，从而创造出自然界中没有的新物种。但是也应当看到，大量的植物品种还没有建立起体细胞杂交的融合体系，并且要获得兼有双亲优良性状的杂合细胞还是非常困难的。此外，体细胞杂种植株的遗传稳定性和可育性也有待科研工作者的进一步研究。

动物细胞工程

动物细胞工程概述

动物细胞培养是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理条件，使之得以生存和生长并维持其结构与功能的技术。早在 1885 年，科学家就进行了动物组织离体培养的尝试。结果表明，离体后的动物组织或细胞在人工条件下仍然能够存活。真正意义上的现代动物细胞培养技术始于美国生物学家哈里森（R. G. Harrison）和法国科学家卡瑞尔（A. Carrel）的开创性工作。哈里森采用淋巴液作为培养基，成功培养了蛙胚神经组织。卡瑞尔特别注意到了实验中无菌操作的重要性，并发现鸡胚胎抽提液具有促进细胞生长的作用，成功培养了多种动物组织。随着对动物细胞离体生长机制的不断了解，人们开始广泛使用各种动物血清来促进细胞的生长，并开发出了人工合成的无血清培养基。同时，还设计出许多新型的动物细胞培养反应器，用于规模化培养。

动物细胞培养技术建立早期，直接采用包括血清在内的多种动物体液作为培养基。在研究和了解细胞生长所需成分的基础上，人们逐渐开发了一系列人工合成培养基。其中成分最简单的是低限量基础培养基（MEM），它包含了无机盐、微量元素、氨基酸、维生素和碳水化合物等 20 多种成分，但在使用时仍需要添加一定比例的动物血清，以补充细胞生长所必需的蛋白质、激素和生长因子等物质。

动物血清培养基固有的缺点主要是血清的成分复杂，会影响实验结果的分析；此外，不同批次的血清生产质量存在差异，会造成培养结果的不稳定。为了解决这些问题，科学家们致力于开发成分明确的无血清培养基。通过在基础培养基中添加相应的组分，以达到促进细胞的增殖和生长的要求。这些组分主要包括促进细胞贴壁的细胞外基质、各类生长因子和激素、酶抑制剂和某些蛋白质。这种成分明确的无血清培养基，已经成为细胞生物学基础研究领域的首选材料。

从动物体获取组织后，首先要通过机械法和消化法实现组织细胞的分散。消化法常用胰蛋白酶等试剂对动物组织块进行消化，使细胞从组织中分离出来。首次细胞培养称为原代培养。用于原代培养的动物活体组织往往由多种细胞组成，所以原代细胞培养物往往是多种细胞的混合物。原代培养后，将细胞从培养瓶中分离稀释，传到新的培养瓶中（传代培养），从而逐步分离获得单一类型的细胞。

在培养过程中，动物细胞非常容易受到各种微生物的污染，因此，必须要在严格无菌的环境下进行细胞培养，并在培养液中加入一定量的抗生素以防污染。同时，动物细胞培养对适宜的外界环境设定和维持也有严苛的要求。例如，适宜的培养温度（如哺乳动物细胞和禽类细胞的适宜温度为 \pu{36.5 \pm 0.5 ^oC}）和 pH（7.2 \sim 7.4）是细胞在体外生长的必要条件；动物细胞的生长离不开氧气的供应，培养液中溶解氧水平会直接影响细胞的生长和代谢；通常在 95\% 的空气和 5\% 的 \ce{CO2} 混合气体中培养，其中 \ce{CO2} 气体是为保持培养液 pH 的稳定；还需要控制适宜的培养液渗透压；培养液中需包含维持动物细胞生长所必需的营养物质。此外，还要定期更换培养液，以便及时清除代谢产物，防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。

时间	内容
1890 年	希普将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例。

胚胎移植的发育阶段与成功率

胚胎移植的成功率与移植时胚胎的发育阶段密切相关。在哺乳动物的胚胎移植中，核心问题并非简单地「阶段越晚越好」，而是需要实现三方面的匹配：胚胎自身的发育潜能、子宫内膜的容受性窗口，以及胚胎与子宫发育的同步性。

天然情况下胚胎进入子宫的时机：以人类为例，受精后约第 3 \sim 4 天，胚胎进入子宫腔，同时开始形成囊胚；第 5 天形成囊胚；第 6 天囊胚开始「孵化」（从透明带中出来），为着床做准备；约第 7 天开始着床；约第 14 天出现原条，这被认为是原肠胚形成的起点。因此，原肠胚阶段是着床之后的发育阶段。

不同发育阶段移植的成功率比较：临床最常见的是卵裂期胚胎移植（受精后第 2 \sim 3 天）与囊胚移植（受精后第 5 \sim 6 天）的比较。囊胚移植通常具有更高的每次新鲜移植活产率，主要原因有两方面：其一，囊胚更接近天然着床时序，胚胎与子宫内膜的时间同步性更好；其二，能发育到囊胚的胚胎经历了一次「自我筛选」，平均而言发育潜能更强。Cochrane 系统综述显示，囊胚移植在每次新鲜移植的活产率上总体更占优势（OR 约 1.39）。

但需要注意的是，累计活产率（包括后续冻胚移植）在不同研究中可能呈现不同结果。对于胚胎数量较少或预后较差的患者，卵裂期移植可能是更稳妥的选择，因为继续培养到囊胚可能导致「无胚胎可移植」的风险。

是否越接近天然进入子宫的阶段越好：「更接近天然时序」是好原则，但并非绝对。胚胎移植成功的关键在于实现「胚胎—子宫同步」，而同步可以通过不同策略实现。在牛、羊等家畜胚胎移植中，供体与受体发情/排卵时序的匹配度会显著影响妊娠率，偏差过大会导致成功率明显下降。

原肠胚阶段能否进行胚胎移植：发育到原肠胚阶段后，基本无法进行常规的胚胎移植。这是因为：原肠胚形成发生在着床之后，胚胎已不再是以「游离状态」存在于子宫腔中；原肠胚细胞高度分化，失去全能性，结构复杂，移植后难以正常着床；同时，原肠胚阶段也触及「原条/14 天」这一关键的伦理法规节点。

胚胎分割与胚胎移植的生殖类型：胚胎分割属于无性生殖。 胚胎分割的本质是将一个早期胚胎分成两个或更多个胚胎，这些胚胎的遗传物质基本相同，本质上是在「复制」同一个受精卵产生的基因型。从生殖方式的判据看，在「分割产生第二个个体」的那一步，没有新的配子融合，因此它不符合「有性生殖 = 配子融合」的定义。原始胚胎通常来自受精（有性过程），但「分割」这一步本身是无性的复制过程。

胚胎移植本身既不是「有性生殖」，也不是「无性生殖」；它是一种「把已经存在的胚胎放入子宫」的辅助生殖操作。 最终这个个体是有性还是无性生殖的产物，取决于胚胎最初是怎么来的：如果胚胎来自精卵受精（自然受精或 IVF），那这个个体的起源是有性生殖（因为发生了配子融合）；如果胚胎来自克隆（例如核移植或胚胎分割得到的「克隆胚胎」）再去移植，那这个个体更接近无性繁殖的产物。

嵌合体与免疫耐受：将两个异父异母的受精卵在卵裂期人为融合形成的嵌合体，一般不会发生免疫排斥。这是因为适应性免疫（T/B 细胞）出现得很晚，「自我」的名单是在发育中被写进去的。如果两套细胞系从非常早期就共同参与了造血系统与胸腺等免疫器官的建成，那么当免疫系统开始学习自我时，两套抗原都会以自体成分的形式被呈现和学习，从而形成共同耐受。免疫系统的建立经历了：首先，造血系统出现并产生免疫细胞；其次，胸腺形成并被淋巴祖细胞定植；最后，T 细胞在胸腺内经历正负选择，建立「哪些是自己、哪些不能打」的规则。如果两套细胞系在胚胎早期就共同存在于一个胚胎里共同构建机体结构，免疫系统会把两者都写进自体白名单。

但也存在例外情况：如果两套细胞系在免疫系统关键部位混合不充分（例如免疫系统几乎完全来自 A 细胞系，而 B 细胞系主要贡献皮肤等靶组织），理论上可能出现免疫系统把另一套组织当外来物的情况。此外，如果嵌合比例过低，耐受可能不稳定，甚至后期被清除。

受精卵的孵化：受精卵的「孵化」（hatching）是指发育至囊胚期的胚胎从透明带中破壳而出，让滋养层细胞直接接触子宫内膜，为着床做准备。在人类 IVF 中，孵化多在受精后第 5 \sim 6 天发生并完成，常在着床前完成或接近完成。囊胚反复膨胀收缩产生机械压力，囊胚与子宫环境相关的酶促降解透明带，以及滋养层细胞的突起穿透等共同作用完成孵化过程。

| 1907 年 | 哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。 | | 1951 年 | 张明觉等发现了哺乳动物精子的获能现象。 | | 1958 年 | 格登用非洲爪蟾进行体细胞核移植实验，成功培育出性成熟个体。同一时期，我国科学家 童第周 等开展了鱼类细胞核移植工作。 | | 1959 年 | 试管家兔诞生。之后，多种试管动物相继出生。 | | 1975 年 | 米尔斯坦 和科勒等创立了单克隆抗体技术。 | | 1978 年 | 小鼠的桑葚胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。 | | 1981 年 | 埃文斯 等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞。 | | 1996 年 | 世界上第一只体细胞克隆羊多莉在英国诞生。随后多种克隆动物相继问世。 | | 2006 年 | 山中伸弥 等获得了诱导多能干细胞。我国科学家用这种细胞培育出了小鼠。 | | 2014 年 | 世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。 | | 2017 年 | 我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。 |

动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产等，都离不开动物细胞培养。**动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。**我们知道，动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，有些细胞还能不断增殖，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件，包括充足的营养、稳定的内环境等。在体外培养动物细胞，也需要满足类似的条件。

营养：细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
无菌、无毒的环境：在体外培养细胞时，必须保证环境是无菌、无毒的，即需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
温度、\pH 和渗透压：维持细胞生存必须有适宜的温度。哺乳动物细胞培养的温度多以 \pu{36.5 \pm 0.5 ^oC} 为宜。多数动物细胞生存的适宜 \pH 为 7.2 \sim 7.4。此外，渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。
气体环境：动物细胞培养所需气体主要有 \ce{O2} 和 \ce{CO2}。\ce{O2} 是细胞代谢所必需的，\ce{CO2} 的主要作用是维持培养液的 \pH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有 95\% 空气和 5\% 的 \ce{CO2} 混合气体的 \ce{CO2} 培养箱中进行培养。

动物细胞培养概述

进行动物细胞培养时，首先取健康动物的一小块组织并剪碎，用胰蛋白酶处理，使其分散成单个细胞，再与特定培养液混合，制成一定浓度的细胞悬液，最后转入培养瓶中，在适宜条件下培养。像这种直接从动物体获取组织或细胞后，进行的第一次培养过程称为原代培养，也叫初代培养。

在从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。因此，在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，或用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞。然后，用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养瓶或培养皿内，置于适宜环境中培养。体外培养的动物细胞可以分为两大类：一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖；另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素的影响外，还会发生接触抑制现象，即当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。这时就需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，将分瓶后的细胞培养称为传代培养。在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。

淋巴细胞、癌细胞等少部分细胞能够在悬浮状态下持续生长，而大部分动物细胞在培养液中悬浮生长一段时间后，会贴附在培养瓶的表面生长，这种现象称为贴壁生长。当培养的细胞生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂，逐渐走向衰亡，这种现象称为接触抑制。培养瓶中的细胞出现接触抑制后，需要用胰蛋白酶将细胞从瓶壁上脱离下来，重新分散稀释成细胞悬浮液，分装到多个培养瓶中继续培养。细胞由原代培养瓶中分离稀释后，转到新的培养瓶中继续培养的过程称为传代培养。

转瓶培养后的细胞一般传至 10 代左右，细胞的生长、分裂就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但也有极少数细胞能存活下来，并可传至 40 \sim 50 代，这种传代细胞称为细胞株。一般情况下，当细胞株传至 50 代以后会再次出现停滞，不能继续传代，但有部分细胞的遗传物质发生了改变，并带有癌变的特点，从而有可能在适宜培养条件下无限传代下去，这种传代细胞叫作细胞系。

原代培养是指细胞或组织离开有机体后的首次培养。取材是原代培养的第一步，所取动物组织块一般体积大于 \pu{1 mm^3}。若直接培养组织块，只有处于周边的少量细胞可以生存和繁殖，大部分中间细胞因不能获得穿透能力有限的营养物质而代谢不良。为了获取大量生长良好的细胞，必须先把组织细胞分散开，使细胞解离出来。解离细胞的方法是先将组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶等消化处理一段时间，使组织松散，细胞分开。再将分散的细胞制成细胞悬液，进一步接种至培养瓶中，在人工控制的培养条件下，进行原代培养。

体外培养的动物细胞往往具有贴壁生长和接触抑制等特点。贴壁是有机体细胞在体内生存和生长发育的基本方式，包括细胞与细胞间的相互接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触。正是基于细胞这种贴壁生长的特征，使得不同细胞之间结合而形成组织，也使得细胞和周围环境之间保持联系。体外培养时，绝大多数细胞仍然保持了贴壁生长的特性，必须贴附在某一固相支持物上如培养瓶壁上生长。来源于血液、淋巴组织的细胞以及某些肿瘤细胞不需要贴附在支持物上，而是呈悬浮生长状态。

接触抑制是体外细胞培养时贴壁型细胞生长的特性。一般情况下，正常的细胞在培养过程中不停顿地活动和运动，其外周的细胞膜呈现一些特征性的皱褶样活动。但是，当细胞由于移动而相互靠近发生接触时，细胞不再移动，接触区域的细胞膜皱褶样活动停止，最终细胞分裂停止，这种现象称为接触抑制。由于细胞之间有接触抑制的特性，一般的正常细胞并不重叠于其他细胞之上生长，而是单层生长。癌细胞由于无接触抑制而能够继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，发生堆积。因此，是否接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。

CO₂ 在细胞培养中的作用：在动物细胞培养中，培养箱通常采用 95% 空气和 5% CO₂ 混合气体。这里的 CO₂ 并不是为了中和新陈代谢产生的酸，而是与培养基中的碳酸氢盐（NaHCO₃）共同构成缓冲体系，维持 pH 在 7.2–7.4 的生理范围。根据 Henderson–Hasselbalch 公式，当培养基配方固定（[HCO₃⁻] 固定）、CO₂ 分压固定，pH 就会稳定在一个值附近。因此，5% CO₂ 的主要作用是「维持缓冲体系的平衡」，防止培养基因 CO₂ 逸出而变碱。

需要注意的是，这个缓冲体系的能力是有限的。当细胞代谢产生大量乳酸等酸性产物时，HCO₃⁻ 会被消耗殆尽，培养基会变酸（酚红指示剂变黄）。此时需要更换培养基，而不是调整 CO₂ 浓度。

血清的作用与现代认识？教材中说血清是因为「成分不完全清楚」而添加，但现代研究已经对此有了更深入的认识：

多模块协同作用：血清不仅含有生长因子，还提供激素因子、运输蛋白、贴壁因子、稳定解毒因子等，是一个多模块的协同网络。
细胞外囊泡（EVs）：近年研究发现，血清中的外泌体携带 miRNA 等调控分子，能直接影响受体细胞的基因表达，这也是血清促进细胞生长的重要机制之一。
批次差异与无血清培养：由于血清成分复杂、批次差异大，在工业界（如生物制药、细胞治疗）正在逐步淘汰血清，改用化学成分限定的无血清培养基。

贴壁生长与接触抑制的原理：

贴壁生长（Anchorage Dependence）：

很多动物细胞在体内本身就「贴」在细胞外基质（ECM）上。在体外培养时，它们需要通过整合素（integrin）识别 ECM 蛋白，在膜上聚集形成黏着斑（focal adhesion），再通过细胞骨架将信号传入细胞内部。

如果细胞「离开基质」，会触发失巢凋亡（anoikis），即一种程序性死亡。这就是为什么很多正常细胞必须贴壁才能存活和增殖。
接触抑制（Contact Inhibition）：
1. 增殖抑制（CIP）：当细胞密度升高、互相接触形成稳定的细胞 - 细胞连接（尤其是 E-cadherin 介导的黏附连接）时，会触发「停止分裂」的信号网络。其中 Hippo–YAP/TAZ 通路非常关键：高密度 → Hippo 打开 → YAP/TAZ 被抑制 → 增殖基因表达下降。
2. 运动抑制（CIL）：细胞迁移时相互碰撞，会发生前缘缩回、重新极化、转向远离接触点等行为。
从细胞周期层面，接触抑制常伴随 p27 等 CDK 抑制蛋白的升高，使细胞停留在 G1 期。

关于动物细胞融合，有几个常考的问题：

两个单倍体细胞融合后：不一定有 2 个染色体组。可能先形成异核体，然后在分裂过程中可能发生染色体丢失。
筛选前的细胞种类：如果题目问「两两融合、筛选前有几种细胞」，常见两种答案：只数融合产物 = 3 种（AA、BB、AB）；把未融合也算进去 = 5 种。
单克隆抗体中用的细胞：标准表述是「免疫动物的 B 淋巴细胞（常取脾细胞）与骨髓瘤细胞融合」。「浆细胞」的说法虽常见，但严格来说成熟浆细胞已高度分化，增殖能力弱。

在动物体细胞核移植（SCNT）中，重构胚需要「激活」才能启动发育。这里的「激活」是指：

模拟受精过程，让卵母细胞内 Ca²⁺ 浓度升高
常用电刺激或化学方法（如 Ca²⁺ 离子载体、乙醇等）
随后解除 MII 期阻滞，使重构胚进入正常的胚胎细胞周期

需要注意，激活时常使用蛋白质合成抑制剂（如 CHX、6-DMAP）来帮助细胞周期转换，而不是「蛋白质合成促进剂」。

重构胚理论上具有发育成完整个体的全能性，因为供体核被卵母细胞胞质重编程回早期胚胎状态。但实际上，由于表观遗传重编程不完全等因素，成功率往往很低（很多体系只有 1% 量级）。

随着时间的延长，体外培养的细胞数量不断增加。当增长到一定程度后，由于发生接触抑制或培养空间的限制及营养物质的消耗枯竭，生长会逐渐减慢，甚至停止并死亡。因此，需要将原培养瓶内的细胞分离并稀释后转到多个培养瓶中，在新的培养基中进行传代培养。一般来说，原代培养的贴壁细胞达到生长基质的 80\% 表面面积后可进行传代培养。若传代过晚，可影响下一代细胞的机能状态。贴壁生长的细胞需经酶消化制成细胞悬液后才能传代。

原代培养物经首次传代成功后即成细胞系（cell line）。如图 3-5 所示，能连续培养下去的细胞系称为连续细胞系（continual cell line）或无限细胞系，不能连续培养下去的细胞系称为有限细胞系（finite cell line）。二倍体细胞通常为有限细胞系，如人的成纤维细胞可传 30 \sim 50 代，相当于 150 \sim 300 个细胞周期。连续细胞系被认为是发生转化了的细胞系（遗传物质发生改变），有的连续细胞系是恶性细胞系，有的连续细胞系虽已获得了不死性（immortality），但保留接触抑制现象，不致癌，是良性无限细胞系。

通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株（cell strain）。细胞株一般具有恒定的染色体组型、病毒敏感性或抗性及其他生化特性。可以连续多次传代的细胞株称为连续细胞株（continual cell strain），可传代次数有限的细胞株称为有限细胞株（finite cell strain）。可见，细胞系是泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系。

细胞株是细胞系经过进一步的克隆培养得到的。把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术，称为细胞克隆（cell cloning）或克隆培养（clone culture）。细胞克隆的最基本要求是：必须保证分离出来的细胞是一个而不是多个，即必须肯定所建成的克隆来源于单个细胞。经过克隆培养后的细胞群，由于来源于一个共同的祖细胞，基因型一致，遗传性状均一，是研究遗传规律和生理特性的重要材料。

细胞是构成生物有机体的基本结构和功能单位。在动物细胞、组织培养技术还不成熟的时期，研究人员主要选取整个动物体或其组织、细胞予以固定，然后通过观察来了解细胞的形态结构和生命活动。动物细胞培养技术完善之后，能直接观察到培养细胞的动态变化过程，从而能直接观察、分析细胞的形态结构和真正意义上的生命活动。培养正常或病变的细胞，可用于生理、病理、药理等方面的研究，例如，细胞全能性的揭示、细胞周期调节控制的分析、癌变机理和衰老原因、抗癌药物的筛选、有毒物质的检测等研究，都与细胞培养技术密不可分。

细胞培养在现实生活中具有重要意义，如皮肤细胞的培养用于烧伤患者的皮肤移植，其他器官的细胞培养用于相关损伤组织器官的修复等。借助于某些细胞的大规模培养获得细胞代谢产物，如获得动物疫苗、干扰素、单克隆抗体等有重要价值的生物制品，是动物细胞培养的重要应用之一。

诱导性多能干细胞

根据干细胞所处的发育阶段，可以把干细胞分成胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是高等动物受精卵发育成囊胚时的内细胞团，能在体外进行培养和传代，并在一定条件下保持分化的全能性，几乎可以分化出所有的细胞类型。胚胎干细胞特有的分化全能性以及可以无限传代增殖且不改变基因型和表现型的生物学特性，决定了它在生物学领域有着不可估量的应用价值。

胚胎干细胞可取自囊胚的内细胞团或是胎儿的原始生殖细胞，其来源非常有限，而且它的获得和使用还涉及非常复杂的伦理问题。鉴于体细胞和干细胞拥有相同的遗传信息，目前可以通过多种技术手段将体细胞诱导形成具有与胚胎干细胞类似分裂和分化能力的干细胞，这样的细胞称为诱导性多能干细胞（iPS 细胞），为干细胞的广泛应用提供了基础。

在哺乳动物的克隆过程中，克隆后代的进一步发育还需要将早期胚胎移植入一个代孕母体的子宫内，我们将这种类型的克隆称为生殖性克隆。治疗性克隆的目的不是产生一个活体生物，而是产生胚胎干细胞，并将其在合适的条件下（如某些生长刺激型蛋白质存在）分化成各种特化细胞乃至形成组织或器官。如果人们能找到正确的条件，便能培养胚胎干细胞用于修复受损或病变器官，如用来置换因脊髓损伤或心肌梗死而损坏的细胞。

干细胞的培养成功是动物细胞培养领域重大的成就之一，在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。成体干细胞是分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新潜能的干细胞，在组织或系统的修复和再生中起着关键作用。

按照分化潜能的大小，可以将成体干细胞分成两种类型。一类是多能干细胞，具有分化出多种细胞组织的能力，但不具备发育成完整个体的能力，如骨髓多能造血干细胞，可以分化出多种不同的血细胞。另一类是单能干细胞，只能分化成一种类型或密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞等。

胚胎干细胞（简称 ES 细胞）存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能，ES 细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞等。一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。造血干细胞是发现最早、研究最多、应用也最为成熟的一类成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。

有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用。例如，将正常的造血干细胞移植到病人体内，恢复病人的造血和免疫功能，已成为治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段；神经干细胞在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）方面有重要的应用价值。

胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。2006 年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称 iPS 细胞），并用 iPS 细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。现在，用 iPS 细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。因为诱导过程无须破坏胚胎，而且 iPS 细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，所以科学家普遍认为 iPS 细胞的应用前景优于胚胎干细胞。

科学家已尝试采用多种方法来制备 iPS 细胞，包括借助载体将特定基因导入细胞中，直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成 iPS 细胞。iPS 细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的 T 细胞、B 细胞等也能被诱导为 iPS 细胞。干细胞的研究正在如火如荼地开展。虽然将干细胞用于临床治疗还面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险，但是我们相信，随着理论和技术的不断完善，干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。

早在 20 世纪 50 年代，人们就开始使用骨髓移植的方法治疗血液系统疾病。到 80 年代末，外周血干细胞移植技术开始逐渐替代传统的骨髓移植。随后，又在脐带血中发现了脐血干细胞。与骨髓和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞移植具有无来源限制、对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，简称 HLA，是决定移植后排斥的主要因素）配型要求较低、不易受到病毒或肿瘤的污染等优点。我国已经掌握了脐血干细胞分离、纯化、冷冻保存和复苏的全套技术，并在上海建立了我国第一个脐血库。

此外，胰岛干细胞最初是从尚未发病的糖尿病小鼠胰导管中分离得到的。将胰岛干细胞经体外诱导分化成产胰岛素的胰岛 \beta 细胞并移植给糖尿病小鼠，接受移植的小鼠血糖浓度控制良好，这为干细胞治疗糖尿病奠定了基础。皮肤干细胞是另一种成体干细胞。我国科学家发现，人体烧伤皮肤原位处存在着皮肤干细胞。在一定的药物诱导下，这样的皮肤干细胞能使烧伤处的皮肤原位再生。这是我国在皮肤干细胞研究及临床上的重大突破。

胚胎干细胞具有分化全能性，但其来源有限且涉及复杂的伦理问题；而各种成体干细胞（除造血干细胞外）的采集往往在技术上非常困难，且不具备分化成所有细胞类型的能力。这些因素都限制了干细胞在临床上的应用。由于体细胞与干细胞都携带着相同的遗传信息，因此，只要能对体细胞的遗传信息表达进行重新编程，理论上就能够获得具有与干细胞类似分化能力的细胞。日本科学家山中伸弥（S. Yamanaka）于 2006 年首先报道了将 4 种转录因子基因组合转入分化的体细胞中，使其重编程，最终成功获得了类似胚胎干细胞的一种细胞类型，即诱导性多能干细胞。山中伸弥因此获得了 2012 年的诺贝尔生理学或医学奖。随后，世界各国科学家陆续发现其他方法同样也可以制造这种细胞。

iPS 细胞技术的出现，在干细胞生物学、表观遗传学以及再生医学研究领域都引起了强烈的反响。在基础研究方面，利用 iPS 细胞作为实验模型，可大大加速对多能性调控机理的深入研究。在实际应用方面，iPS 细胞的获得方法相对简单和稳定，不需要使用卵细胞或者胚胎，这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势。iPS 细胞的建立进一步拉近了干细胞与临床疾病治疗的距离，在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在应用价值。我国科学家在 iPS 细胞研究领域取得了一系列重大成果。2009 年，研究团队从小鼠皮肤细胞培育出世界首例来自 iPS 细胞的可育小鼠，证实了 iPS 细胞发育全能性这一关键科学问题。2022 年，我国科学家在国际上首次实现了运用化学小分子将人成体细胞转变为 iPS 细胞。这些重大原创性成果的取得，使我国在干细胞基础理论和应用的一些领域中处于国际引领地位。

组织工程是干细胞应用研究的重要方向之一。组织工程的基本原理是：首先从自体或异体组织中分离干细胞，经体外扩增达到一定的细胞数量后，将这些细胞作为种子细胞种植在预先构建好的聚合物骨架上。在适当的生长条件下，细胞沿着聚合物骨架生长和分化，最终发育成具有特定形态及功能的工程组织。借助组织工程技术，科学家们已经获得了组织工程化的皮肤、骨骼、血管等器官，有望解决临床上急需的人工组织与器官问题。

1975 年，科学家建立了淋巴细胞杂交瘤技术，解决了单克隆抗体制备的难题。在该流程中，从众多细胞中筛选出能产生针对某一特定抗原决定簇的杂交瘤细胞，是单克隆抗体制备的关键。科学家采用缺失次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）基因的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾脏细胞进行融合，然后将经融合操作后的细胞置于添加了含有次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶（T）的动物细胞培养基（HAT 培养基）中进行筛选，成功得到了杂交瘤细胞。已知氨基蝶呤能阻断次黄嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸的生物合成。

经过 HAT 培养基筛选出的杂交瘤细胞仍有多种类型，每一种杂交瘤细胞产生的抗体特异性针对某个抗原决定簇。因此，需要经过第二次筛选才能获得针对某一抗原决定簇的特异性 B 淋巴细胞。第二次筛选通常采用稀释法，即将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞，而后进行相应的处理以便筛选出所需的单个杂交瘤细胞。

动物细胞融合技术

受精过程是生殖细胞之间的自然融合。此外，科学家陆续发现体细胞之间也会有融合现象：首先是在脊椎动物肿瘤细胞中观察到了多核现象；随后，在骨髓、肺等正常组织及炎症或坏死部位也都发现了多核现象。细胞培养技术问世后，体细胞融合在体外培养的肿瘤细胞中得到了验证。现代生物工程中的细胞融合指的是体细胞杂交，即在离体条件下，用人工方法将不同生物或同种生物不同类型的单细胞融合成一个杂合细胞。

某些病毒（灭活）如仙台病毒可以诱发细胞融合形成多核细胞，这一发现开创了细胞人工融合的新领域。除了病毒促融外，细胞融合还可采用物理、化学等手段，使两个甚至多个动物细胞融合形成一个细胞。物理方法如电融合，在高压脉冲电场的作用下，细胞膜表面会形成大量微膜孔，进而发生细胞融合现象。化学方法如聚乙二醇（PEG）或其衍生物，具有比仙台病毒高数百倍的促细胞融合效率。细胞融合技术可以使人们按照预先的设计使不同的细胞融合，创造出新的杂合细胞。

聚乙二醇诱导融合法因其使用方便且诱导细胞融合的成功率高，是较为常用的细胞融合方法。当然，聚乙二醇也有一定的局限性，如有一定毒性，对某些细胞（如卵细胞）不适用。聚乙二醇分子因能改变细胞质膜的结构，而被广泛地作为促进细胞融合的化学试剂，用于促进形成杂种细胞。

单克隆抗体问世后，因其特异性强而被大量应用于临床。单克隆抗体既可以用于疾病的诊断，也可用于疾病的治疗。如利用单克隆抗体可特异性识别抗原物质的特点，研制出了具有精确“定位”能力的抗癌“药物导弹”，它能将药物准确地引导到癌细胞表面并予以攻击，以提高抗癌药物的特异性和抗癌效率。

动物细胞融合技术比较突出的成就是单克隆抗体的制备。抗体是机体免疫应答的一个重要组成部分，可以特异性识别抗原。但绝大部分的抗原拥有多个不同的抗原决定簇（即抗原分子中决定抗原特异性并刺激 B 淋巴细胞分化为浆细胞的特定区域），会同时刺激多个不同的 B 淋巴细胞形成克隆群。所以，针对同一个抗原，机体往往会产生多种抗体。有些抗体通常存在特异性不强、质量不稳定等问题，且经抗原激活后的 B 淋巴细胞也无法在体外长时间培养。那么，是否可以得到针对某一特定抗原决定簇的、高度均一的抗体呢？科学家们在患骨髓瘤的小鼠体内发现了骨髓瘤细胞，该细胞在体外培养时能无限增殖。于是，科学家便设想：是否可以利用细胞融合技术，将 B 淋巴细胞的单一抗体合成和分泌能力与骨髓瘤细胞的体外无限增殖特性融为一体呢？

为了验证这一设想，1975 年，德国科学家克勒（G. Köhler）和阿根廷科学家米尔斯坦（C. Milstein）以绵羊红细胞作为抗原刺激小鼠脾脏的 B 淋巴细胞，获得了能产生抗体的浆细胞，后者在促融剂的作用下与小鼠骨髓瘤细胞发生融合，形成了杂交瘤细胞。通过选择培养基筛选出抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，并对其进行克隆培养。这样获得的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能持续分泌高度均一、仅针对某一特定抗原决定簇的抗体，即单克隆抗体。

制备单克隆抗体的流程主要有：抗原准备及动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、杂交瘤细胞的增殖及抗体提取等。单克隆抗体的高度特异性可用于鉴定各种抗原，对多种疾病的诊断、治疗以及生理过程的检测具有重要价值。例如，利用单克隆抗体的靶向作用，可将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，将其携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，降低对健康组织与细胞的伤害（即靶向性治疗）。再如，早孕检测试纸可通过尿液快速检测出受孕妇女胎盘中产生的人绒毛膜促性腺激素。

动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同。诱导动物细胞融合的常用方法有 PEG 融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。人们可以按照预先的设计使不同细胞融合，至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。目前，这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。

早期人们为了获得抗体，就向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。用这种方法制备的抗体不仅产量低、纯度低，而且特异性差。为了解决这一难题，科学家进行了多年的研究和探索。他们发现，哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的 B 淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种，但每一个 B 淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的 B 淋巴细胞，形成细胞群。1975 年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案。他们想到，如果把一种 B 淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。根据该设想，通过实验，他们得到了单克隆抗体。

用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的 B 淋巴细胞。
用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。

使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC 通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。

单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备，因此被广泛用作诊断试剂，在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。例如，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。除前面介绍的单克隆抗体可以运载药物外，单克隆抗体自身也能用于治疗疾病。在医药领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。

上文提到，细胞融合技术甚至可以使动物和植物之间的细胞融合获得成功。一个有趣的思维实验是：如果将一个去除了细胞壁的植物原生质体与一个动物细胞进行融合，结果会怎样？从细胞水平上看，这种融合在物理上是可以实现的，但融合产物无法发育成一个能长期存活的动植物杂交新物种。

融合机制：去除细胞壁后的植物原生质体与动物细胞的最外层都是细胞膜。所有生物的细胞膜基本骨架都是磷脂双分子层，具有一定的流动性。在 PEG（聚乙二醇）、灭活的仙台病毒或电脉冲等诱导剂的作用下，两种细胞膜可以发生融合。

融合后的产物——异核体：刚刚融合成功的细胞被称为异核体（Heterokaryon），其中同时包含一个植物细胞核和一个动物细胞核，动物的线粒体、中心体与植物的叶绿体、大液泡混合在一起。这种混合细胞在短期内（几天到几周）是可以存活的，甚至能够进行基础的新陈代谢。

长期结局——无法存活和增殖：在后续培养中，杂种细胞面临无法逾越的生物学鸿沟：

染色体丢失：由于动植物的染色体结构和分裂机制（如纺锤体的形成方式）差异巨大，杂种细胞尝试分裂时通常发生染色体单向丢失，其中一方的染色体会被逐渐排斥、丢失或断裂。
代谢环境不兼容：动物细胞通常需要 37℃ 的培养环境，而植物细胞最适温度一般在 20 \sim 25℃ 左右，且两者培养基成分完全不同，找不到能让两者同时适应的培养条件。
基因调控系统不协调：即使两个细胞核融合，动物的转录因子也无法识别植物的基因启动子，反之亦然，细胞内部的信号传导会陷入极度混乱。

科学家在 20 世纪 70 年代就已经做过此类实验。1976 年，科学家将人类 HeLa 细胞与烟草、胡萝卜的原生质体进行了融合，融合后的杂交细胞确实存活了一段时间，人类细胞核和植物细胞核在同一个细胞中共存，但它们无法形成稳定的细胞系，最终停止分裂并死亡。科学家还做过鸡红细胞与酵母菌、人类细胞与蚊子细胞等各种跨界融合实验，结果类似。

因此，人们能得到一个包含动植物遗传物质和细胞器的异核体，但不能得到一个宏观的动植物杂交生物。这类实验的主要价值在于基础科学研究，如研究基因表达的调控、细胞膜的流动特性等。这也是为什么体细胞杂交技术在实际应用中只用于亲缘关系相对较近的物种之间。

动物细胞核移植技术

细胞核移植是将一种动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的过程。所产生的后代具有与细胞核供体基本相同的遗传成分。科学家首先用两栖类动物成功地尝试了此技术，并陆续在绵羊、小鼠、牛、山羊等哺乳动物中获得了胚胎细胞核或体细胞核移植的后代。

细胞核移植技术是目前动物克隆的主要手段。所谓克隆（clone）是指分子、细胞或个体的无性繁殖系，如从一个分子复制成一组分子称为分子克隆；从一个细胞分裂生成一群细胞称为细胞克隆；动植物个体的无性繁殖就是个体克隆。

动物克隆技术通过显微操作，将供体细胞的核移入去核的卵母细胞中，经过人工活化和体外培养后，再移植入代孕母体内，使其发育成为含有与供体细胞相同遗传物质的个体，该过程便是典型的个体克隆。克隆羊“多莉”是人类首次用成年动物的体细胞细胞核移植获得的克隆后代。“多莉”的诞生证明了哺乳动物高度分化的体细胞核能够在卵母细胞细胞质的作用下恢复其全能性，为细胞全能性理论增添了有力的实验证据。

什么是重构胚？在体细胞核移植（SCNT）技术中，重构胚（reconstructed embryo） 是指将供体细胞核导入去核卵母细胞后，经人工方法激活并启动分裂发育的核移植胚。由于精子未参与受精，科学家必须用人工方法模拟受精过程来「唤醒」这个重构胚。

激活的核心是模拟受精时引发的 \ce{Ca^2+} 信号变化：

常用物理方法：电刺激（电脉冲），通过膜电位变化引发胞内 \ce{Ca^2+} 振荡。
常用化学方法：\ce{Ca^2+} 离子载体（如 ionomycin）、锶离子（\ce{SrCl2}）等，直接诱导 \ce{Ca^2+} 上升。

这些 \ce{Ca^2+} 信号能够解除卵母细胞的 MII 期阻滞，使其退出减数分裂阻滞，进入正常的胚胎细胞周期。

关键易错点：抑制剂而非促进剂。

在很多方案中，激活过程还会配合使用以下试剂作为辅助：

6-DMAP（6-二甲基氨基嘌呤）：蛋白激酶抑制剂。
CHX（环己酰亚胺 / 放线菌酮）：蛋白质合成抑制剂。

常见的考点陷阱是将 CHX 误写为「蛋白质合成促进剂」。正确的表述应为「蛋白质合成抑制剂」。其原理是：处于 MII 阻滞的卵母细胞内存在高水平的成熟促进因子（MPF，主要成分包含 Cyclin B）。使用蛋白质合成抑制剂可以阻断 Cyclin B 等维持阻滞状态的蛋白质的继续合成，使 MPF 活性下降，从而解除 MII 阻滞，启动 DNA 复制和细胞分裂。若使用「促进剂」，反而会维持阻滞状态，重构胚无法继续发育。

理论与现实的差距：

理论上：重构胚的供体核被卵母细胞胞质重编程回早期胚胎样状态，应具备像受精卵那样的全能性，可以发育成完整个体。
实际上：由于表观遗传重编程不完全（如早期胚胎基因不能正确重启、DNA 甲基化与组蛋白修饰重置不彻底），重构胚的发育成功率通常很低。在某些家畜体系中，克隆效率可能只有 0.5\% \sim 1.0\% 的量级。
额外注意：重构胚的核 DNA 来自供体细胞，但线粒体 mtDNA 通常主要来自受体卵母细胞，因此并非「遗传物质 100% 相同」的简单复制。

采用体细胞克隆技术成功获得了克隆羊、克隆小鼠和克隆牛后，科学家又向与人类相近的灵长类动物的体细胞克隆发起了挑战。2017 年，在中国上海诞生了世界首例非人灵长类动物体细胞克隆后代“中中”和“华华”。体细胞克隆猴的成功以及未来基于体细胞克隆猴的疾病模型的创建，将有效缩短药物研发周期、提高药物研发成功率。这将使我国率先发展出基于非人灵长类动物疾病模型的全新医药研发产业链，促进针对阿尔茨海默病、自闭症等脑疾病以及人类免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病的新药研发进程。

克隆技术具有广泛的应用前景。在农牧业中，可将具有特殊期望性状的动物通过克隆产生更多的畜群；在科学研究中，基因完全相同的动物可为有关实验提供最佳的“对照动物”；在制药行业中，人们正在尝试用克隆动物生产具有潜在医疗用途的产品；在野生物种保护中，可利用克隆技术繁殖濒危物种，为生态保护带来了无限希望。然而，克隆技术本身还有很多问题未能解决。不断增加的证据显示，克隆动物的健康水平较差，很多克隆动物表现出诸如肥胖、肺炎、肝功能低下、早衰性死亡等方面的缺陷。例如，克隆绵羊“多莉”寿命仅 6 岁，因身患通常仅在年老绵羊中才会出现的肺部疾病并发症，于 2003 年死亡，而与其共同饲养的非克隆同伴预期寿命可达 12 年。

**动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。**哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。由于动物胚胎细胞核分化程度低，表现全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。而在动物体细胞核移植中，非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难。主要原因一方面是供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；另一方面是对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。

体细胞核移植技术在畜牧业、医药卫生以及其他领域有着广泛的应用前景。在畜牧生产中，利用体细胞核移植技术，可以加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育。在医药卫生领域，通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以用于异种移植；以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免发生免疫排斥反应。此外，研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因；克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。在保护濒危物种方面，该技术有望增加濒危物种的存活数量。

尽管通过体细胞核移植技术已经获得了多种克隆动物，但该技术的成功率仍然非常低，各个技术环节也有待进一步改进。相对于技术研究，核移植的理论研究较为滞后，需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合。此外，一些研究者指出，绝大多数克隆动物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体形过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。总之，体细胞核移植技术的研究仍在继续深入，人类对克隆技术的应用还有许多问题需要解决。期待在不远的将来，克隆技术能更好地造福于人类。

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